RANKL-RANK活化整合素αVβ3导致足细胞损伤的机制

Podocyte injury is a key step in the progression of chronic renal disease, but the mechanisms are not clear. We and other group found that integrin alpha V beta 3 activation is podocyte injury triggers, and receptor activator of nuclear factor kappa B ligand (RANKL) and its receptor (RANK) is closely related to integrin alpha V beta 3 activation. Our experiments showed that RANKL directly activated the alpha V beta 3 in vitro, and the expression of beta 3 is decrease in the RANK gene knockout mouse model. Thus, we hypothesized that RANKL-RANK may regulate the activity of alpha V beta 3. On the basis of the above, this project intends to use chromatin immunoprecipitation assay(CHIP) and co immunoprecipitation techniques(COIP) to answer three question.The first question is to investigate the role of transcription factor Egr-1 in RANKL-RANK signaling upregulation of beta 3 expression, the second question is to understant whether there is interaction relationship between RANK and beta 3 protein, and the last question is to identify the alpha v beta 3 activation in the RANKL-RANK mediated chronic kidney disease RANK gene knockout and RANK transgenic mice. This study reveal new mechanisms of chronic nephropathy, and open up new ideas for chronic kidney disease early diagnosis and treatment.

足细胞损伤是慢性肾病进展的关键环节，其确切机制尚不清楚。我们及其他课题组证明整合素αVβ3活化是足细胞损伤的触发因素，与核因子κB受体活化因子配体（RANKL）及其受体（RANK）表达上调密切相关。预实验发现：体外RANKL直接活化足细胞αVβ3；在足细胞RANK基因特异敲除小鼠模型中，足细胞αVβ3活性降低，表达下降。由此，我们推测RANKL-RANK可调控αVβ3活性，但机制不清。在上述基础上，本研究拟用染色质免疫共沉淀及基因敲除等技术，首先明确转录因子EGR-1在RANKL-RANK信号途径上调β3亚基中作用，其次阐明RANK与β3亚基之间相互作用对αVβ3活性的调控作用，并进一步利用RANK基因敲除及转基因小鼠，验证αVβ3激活在RANKL-RANK介导足细胞损伤中的作用。本研究将从RANK-αVβ3介导足细胞损伤的角度揭示慢性肾病发生的新机制，为慢性肾病早期诊断及治疗开辟新思路。

慢性肾脏病(CKD)是当前中国面临的重大健康问题。肾小球足细胞损伤导致足细胞脱落、疤痕形成及最终肾小球硬化，足细胞损伤导致了CKD的发生及发展。近年来研究表明：整合素αVβ3活化是足细胞损伤的关键因素，而导致αVβ3活化的原因未完全阐明。.本研究利用Cre-LoxP重组酶系统制备RANK足细胞特异性敲除鼠（RANK-/- Cre T），用LPS建立足细胞损伤蛋白尿模型。LPS刺激小鼠出现明显蛋白尿，但RANK-/- Cre T组小鼠尿白蛋白肌酐比值明显低于对照组W组。电镜结果显示RANK-/- Cre T组LPS后小鼠足细胞足突融合情况较对照组W组。Westernblot结果显示W组LPS后integrin-β3表达明显升高，但RANK-/-组较对照组升高少。构建足细胞特异性表达RANK转基因小鼠(RANK-Tg)。LPS刺激后RANK-Tg组小鼠的蛋白尿明显较对照组多，与αVβ3的活化明显相关。.在糖尿病肾病（DN）患者、发展为DN的db/db小鼠足细胞中、体外培养的足细胞经高糖干预后RANK表达均明显升高。在STZ诱导的I型DN小鼠中，我们发现足细胞特异性RANK敲除可明显保护肾功能、减少蛋白尿，减轻足细胞损伤、系膜基质扩张和基底膜增厚。STZ触发的氧化应激和炎症在RANK TG小鼠中明显升高，而在RANK-/- Cre T小鼠中降低。特别是NADPH氧化酶4 (NOX4)及其伴侣P22phox在RANK TG小鼠中表达增强，而在RANK-/- Cre T小鼠中表达明显减弱。在足细胞的细胞核中，RANK TG小鼠的转录因子NFκB-p65表达明显增高，而RANK-/- Cre T小鼠的核转录因子NFκB-p65表达明显降低。通过ChIP和荧光素酶报告分析揭示核转录因子NFκB-p65可以与NOX4和P22phox的启动子区域结合，并增加基因启动子活性。.总之，本研究发现RANKL-RANK信号参与αVβ3表达调控，高糖诱导足细胞的RANK表达增高，RANK又通过核转录因子NFκB- p65引起NOX4和P22phox的表达增加，从而与炎症细胞因子TNF-a、MAC-2和IL-1β一起导致足细胞损伤。本研究从RANK介导足细胞损伤的角度揭示慢性肾病发生的新机制，为慢性肾病早期诊断及治疗开辟新思路。