籼稻品种Jefferson中广谱抗瘟基因的图位克隆与进化分析

水稻是我国第一大粮食作物，稻瘟病是水稻的最主要病害之一，而控制稻瘟病危害的最有效策略是发掘和利用抗性基因尤其是广谱抗性基因。我们在前一个已结题的国家自然科学基金项目研究中，鉴定出了一个广谱抗稻瘟病籼稻品种Jefferson，并将目的抗性基因定位在第6号染色体Pi2/9位点的RM7178和RM7311两个SSR分子标记之间，然后通过基因组BAC文库构建与筛选获得了两个目的BAC克隆。本申请项目将在这两个BAC克隆测序与基因精细定位的基础上，通过候选基因的分离与亚克隆以及功能分析，图位克隆目的功能基因，并进一步分析和探讨水稻Pi2/9位点广谱抗稻瘟病基因的分子进化特点及广谱抗性形成的分子机理。本项目研究成果不仅可以为水稻抗稻瘟病分子育种提供新的基因种质资源，而且将为深入开展稻瘟病抗性分子机制研究提供新的重要信息。

水稻是我国乃至世界的重要粮食作物，稻瘟病是水稻的最主要病害之一，而鉴定、克隆和利用抗瘟基因尤其是广谱抗性基因，是控制稻瘟病危害的最有效、经济和环保的策略。本项目以引自美国的广谱抗瘟水稻品种Jefferson为研究材料，在前期基因等位性分析和初步定位基础上，精细定位目的基因，构建和筛选Jefferson基因组BAC文库，测序分析阳性BAC克隆，进一步图位克隆目的基因，并分析基因及基因位点分子进化特点，为深入解析稻瘟病广谱抗性分子机制和水稻抗瘟分子育种提供新依据。获得了如下主要研究结果:通过基因位点特异分子标记设计，利用Jefferson×CO39的F2扩大群体，将目标基因Pi2-2精细定位在水稻第6号染色体Pi2/9位点的两个分子标记RM19817和 AP5659-3之间的0.17cM范围内，物理距离约270kb；利用精细定位结果中与Pi2-2基因紧密连锁的分子标记，筛选Jefferson基因组BAC文库，获得了2个新的阳性克隆，并完成了两克隆的测序；根据BAC克隆序列，利用生物信息学手段和等位同源克隆方法，分离克隆了Pi2-2候选基因的完整序列并分析了基因（蛋白）的结构特点（基因编码区全长DNA 8442bp，包括4个外元和3个内元；基因全长cDNA 3582bp，编码一个1193aa的NBS-LRR类型蛋白；Pi2-2蛋白含有3个结构域，即Coiled-coil、NBS和LRR结构域）；构建了用于基因功能验证的表达载体，开始了农杆菌介导的遗传转化；通过比对Pi2-2候选基因序列与该位点已克隆的Pi9、Pi2、Piz-t、Pi50其他4个稻瘟病抗性基因序列，分析了Pi2-2候选基因（蛋白）的分子进化特点，表明Pi2-2在进化上与已克隆的广谱抗瘟基因Pi9具有更高的同源性；通过室内活体接种，进一步明确了Pi2-2是一个抗谱非常广的新基因，与Pi9存在交叉抗菌谱，暗示Pi2-2基因具有广阔的生产应用前景；在Pi2-2基因精细定位和图位克隆基础上，开展了水稻稻瘟病抗性定向改良的分子育种实践。本项目研究成果为深入解析水稻稻瘟病广谱抗性的分子机制、基因及其位点的分子进化规律和分子育种实践，提供了新的基因资源和重要研究基础。