结构照明宽场相干反斯托克斯拉曼散射显微技术研究

Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) microscopy as a new tool to generate contrast based on vibrational spectra of the sample molecules avoids the photobleaching problem induced by fluorophore labeling.For this reason,CARS microscopy has become a widely used nonlinear Raman technique in biomedical imaging. Most of the CARS microscopes developed so far are based on scanning the tightly cofocused pump and Stokes beams over the sample.Scanning systems offer high spatial resolution and axial sectioning capability, but image generation is time consuming..Structured illumination microscopy with axial section capability has recently met a lot of interest, since it combines advantages of short image acquisition times and high 3D spatial resolution.In this project,We present a video-rate wide?eld CARS microscopy using a structured illumination scheme. This technique allows for simultaneous imaging of a large ?eld of view with 3D section capability, which makes new way for investigations of dynamic biological processes and biochemical imaging.

相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微作为一种基于分子内部能级振动、利用非线性效应的光学显微技术，克服了传统荧光显微技术因荧光分子的介入给样品分子结构和成像方式带来的不利影响，在生物医学观测成像领域有着广泛的应用。目前的CARS显微系统主要是基于共聚焦显微点扫描的成像方式，虽然具备三维层析成像的能力，但因此牺牲了成像速度，在活体微小样品的动态观测和高分辨三维功能性成像时受到了极大地限制。本研究提出一种基于结构照明方式的宽场CARS显微技术，结构照明CARS显微技术具有更高的时间分辨率和空间分辨率，更适合活体生物组织的实时成像。本项目研究将为生物医学成像领域的应用提供一种新的思路和技术手段。

本项目对结构照明宽场相干反斯托克斯拉曼散射显微理论和技术进行了深入的研究，重点解决其中的CARS显微中利用高频结构光实现超分辨成像的理论、快速硬件实现、超分辨图像重构算法问题。采用数字微镜器件产生结构照明光来提高显微装置的成像速度和稳定性；首次将单光束相位成像技术应用于宽场相干反斯托克斯拉曼散射显微CARS成像，有效地抑制了CARS成像中的背景噪声；提出并实现了一种新的三维结构照明解码算法，比现有算法提高30%的图像采集速度且具有更好的环境适应性；将电调焦透镜（ETL）应用于自动对焦，实现了最快170ms的显微镜对焦速度；提出一种基于图像重组变换（IRT algorithm）的超分辨重建算法，具有计算耗时少、重建像质高和适用范围广等特点。这些研究成果为高性能实用化结构照明宽场相干反斯托克斯拉曼散射显微镜的开发和应用打下良好的理论和技术基础。.本项目执行期间在Scientific Reports、Opt. Express、Biomed. Opt. Express、PLOS ONE等学术期刊发表论文9篇，其中SCI收录9篇，其中发表于Scientific Reports的研究论文下载已超过2.5万次，他引63次。参与撰写了一部专著《Optical nanoscopy and advanced microscopy techniques》中的第2章。授权发明专利1项；申请发明专利1项并已启动国际专利PCT程序。本项目执行期间，雷铭研究员共做国内外学术会议报告10次，其中国际会议特邀报告7次，国内会议特邀报告1次。与德国、美国同行开展了富有成效的国际合作研究；项目执行期间培养博士研究生2名，硕士研究生2名。项目组1人获得国家自然基金委优秀青年科学基金（雷铭），1人获得中国科学院院长特别奖（但旦），1人获得中国科学院三好学生（祈雨娇）。项目组2013年获得陕西省重点科技创新团队项目“超分辨成像技术”资助。项目组获得2016年中国光学工程学会科技创新二等奖：“结构照明光学超分辨和三维层析显微技术”