microRNA-29b调控Wnt/β-catenin通路介导急性髓系白血病细胞耐药的机制研究

Resistance to chemotherapy is one of the main reasons for recurrence and refractoriness of acute myeloid leukemia. The mechanism of drug resistance is not very clear. Recently, microRNA-29b has been shown to induce global DNA hypomethylation and tumor suppressor gene reexpression in acute myeloid leukemia by targeting DNMTs. In the preliminary study, we found that down-regulation of DNMTs subsequent inhibition of Wnt/β-catenin signaling result in enhancing the anti-leukemia effect in AML cells. So we propose the hypothesis that microRNA-29b affect the AML cell drug resistance by regulation of Wnt/β-catenin signaling. In this study, we will explore the role of microRNA-29b in AML drug resistance, the enhancing anti-leukemia effect and reversal effect of DNMTs inhibitor by regulating of Wnt/β-catenin signaling, using a series of cell biology, molecular biology methods and animal experiments. The results of this study may provide a novel therapeutic target of drug resistance AML.

急性髓系白血病(AML)常规化疗的长期生存并不理想，对化疗耐药是AML治疗失败的主要原因之一，但机制目前尚未完全明确。已有研究发现miRNA-29b能靶向抑制DNMTs下调基因甲基化。我们前期研究发现通过下调DNMTs抑制Wnt/β-catenin通路能增强AML细胞对化疗药物IDA的敏感性。近期又有研究报告Wnt/β-catenin通路下游基因c-myc参与了AML细胞耐药。因此我们假设miRNA-29b通过靶向DNMTs调控Wnt/β-catenin通路介导AML细胞耐药。本课题我们将应用MTT、miRNA转染、siRNA干扰及动物实验等，研究miRNA-29b在AML细胞耐药中的作用，及对Wnt/β-catenin信号通路的调控，并进一步揭示microRNA-29b在DNMTs抑制剂-地西他滨增强化疗敏感性、逆转AML耐药中的作用及机制。该研究成果可能为耐药AML提供新的治疗思路。

目前对化疗耐药是AML难治复发的主要原因，探索耐药相关机制及寻找能够克服耐药的方法仍是亟待解决的问题。microRNA是一类重要的非编码调控基因，在众多恶性肿瘤中有存在表达异常。有研究发现microRNA-29b在AML中是一个预后良好的因子，它能直接或间接靶向DNMTs。我们前期研究中发现DNMTs抑制剂能通过下调wnt/β-catenin通路增强AML的化疗敏感性。基于以上信息，我们认为microRNA-29b可能在AML的耐药机制中存在调控作用。在本研究中1.我们首先用RT-PCR检测了复发难治和化疗敏感AML患者中骨髓标本，化疗敏感和耐药AML细胞株中的microRNA-29b的表达情况。2.通过慢病毒转染在AML耐药细胞株HL-60/ADR和K562/ADR中上调microRNA-29b，用MTT和集落培养试验检测细胞对IDA和HHT的敏感性。3.在AML静脉荷瘤和皮下荷瘤小鼠中验证microRNA-29b对AML耐药的逆转作用。4.用RT-PCR、Western Blot、萤光素酶报告试验检测microRNA-29b对DNMTs的调控作用。5.用M-PCR、RT-PCR和Western Blot检测microRNA-29b对wnt/β-catenin通路的调控作用。结果显示1.microRNA-29b在难治性AML骨髓标本和耐药细胞株HL-60/ADR和K562/ADR的表达明显减低。2.microRNA-29b上调后增加了耐药细胞株对IDA和HHT的敏感性，尤其对HHT敏感性增加更为显著。3.在静脉荷瘤和皮下荷瘤AML小鼠模型中，microRNA-29b上调能增加HHT的敏感性，降低AML细胞负荷，延长小鼠生存。4.microRNA-29b能直接靶向DNMT3A而下调DNMT3A，而对DNMT3B和DNMT1无明显的下调作用。5.microRNA-29b上调能降低WNT拮抗因子DKK3和SFRP1的甲基化，使其mRNA和蛋白水平不同程度的上调。对该通路关键因子β-catenin有蛋白水平下调或抑制入核的作用。对下游靶基因c-myc有蛋白水平的下调作用。本研究发现microRNA-29b 对AML耐药有一定的逆转作用，靶向DNMT3A及抑制wnt/β-catenin通路是其重要的机制之一。该研究发现可能为寻找治疗复发难治AML的新方法提供线索及依据。