核酸适配体抑制水貂阿留申病毒抗体依赖增强作用及其机制研究

Aleutian mink disease virus (AMDV) causes a persistent infection associated with immune complex disease, hyper gamma globulinemia, and high levels of antiviral antibodies. Pre-existing antibodies may enhance viral infections by antibody dependent enhancement (ADE). ADE is a major cause of the host immune dysfunction and the immune failure of vaccine. We suspect that, the antiviral antibodies, which produced by the existing biological system, can’t block the special virus antigenic epitopes, and virus could re-infect the host cells mediated by the antigen-antibody complexes. So, we assume that aptamer can be used for the research of antiviral effect and mechanism, and the obtained aptamer can significantly inhibit the ADE of AMDV infection. The previous experimental work showed that the aptamers for AMDV-VP2 protein had been selected, and the antiviral actions of the aptamers were examined. Based on works we had done before, these works would continue, including: (1) the antiviral aptamers with good affinity and specificity will be identified; (2) the infection cell model for the ADE of AMDV infection will be established base on the FcγRIIb gene overexpression CRFK cell line; (3) the aptamer mediated antiviral mechanism research for the ADE of AMDV infection. This research can provide new work ideas and methods to the study of antiviral mechanism for AMDV, further provide direct experimental basis to anti-AMDV drug discovery.

水貂阿留申病毒(AMDV)感染宿主能引起显著的抗体依赖增强作用(ADE)，这也是导致宿主免疫功能紊乱和疫苗免疫失败的主要原因，我们推测这可能是由于AMDV诱导产生的抗体只能封闭病毒表面特定的有限表位，而引起病毒再次感染的表位可能未受影响。因此，我们提出“利用核酸适配体开展AMDV抗病毒作用及机制研究”，以期获得能显著抑制AMDV ADE作用的核酸适配体。我们在完成AMDV VP2蛋白核酸适配体筛选的基础上，继续研究，拟达到如下目标：(1)鉴定出具有高亲和力、高特异性和抑制病毒增殖的核酸适配体；(2)构建水貂FcγRIIb基因过表达CRFK细胞系，建立AMDV-ADE细胞模型；(3)验证核酸适配体抑制AMDV的ADE作用，探讨核酸适配体在FcγRIIb介导AMDV ADE过程中发挥作用的分子机制。通过本研究实施，可以为AMDV引起ADE机制研究提供新思路，也可以为抗AMDV药物研发奠定基础。

水貂阿留申病毒侵染宿主后能引起显著的抗体依赖增强作用，也是AMDV导致宿主免疫功能紊乱主要原因。核酸适配体能通过与靶分子特异性结合影响靶分子的生物活性和生物学功能。因此，我们提出“利用核酸适配体开展AMDV抗病毒作用及机制研究”，以期获得能明显抑制AMDV的核酸适配体。本研究首先以偶联有AMDV-VP2蛋白的磁珠为靶标，经过10轮SELEX筛选后，获得3个亲和力和特异性良好的核酸适配体（ADVa001，ADVa012和ADVa014）。抑制病毒增殖试验结果显示，ADVa012抑制率达到47%，ADVa012在细胞的半衰期约为32h，且对细胞增殖活性没有明显影响。适配体结合位点分析结果显示ADVa012与VP2蛋白结合的优势区域位于P4（aa397-aa474）区域。为了研究核酸适配体抗AMDV病毒机制研究，本研究采用脂质体介导法，将重组质粒pCDNA3.1(+)- CD64转染CRFK细胞，建立过表达水貂CD64基因的细胞系。qPCR和IFA实验均显示，AMDV-HLJ毒株能在过表达水貂CD64基因的CRFK细胞上进行有限复制。使用不同稀释度的单抗与AMDV-HLJ毒株共同作用后感染该细胞系，不同抗体浓度、亲和力和病毒/抗体比例对AMDV-ADE细胞感染模型影响不大，过表达水貂CD64基因没有明显提升AMDV-HLJ毒株在CRFK细胞上的增殖活性，加入不同浓度的单抗也没有明显改善其增殖特性，分析原因，可能是毒株的适应性的原因。因此，本研究利用全基因合成的方法，获得了荧光素酶报告系统的pBlue-AMDV-G(pADV)质粒，经过连续传代、病毒基因组拷贝数及转录水平测试，基本建立了AMDV的感染性克隆。为了研究核酸适配体抗病毒作用机制，我们利用pADV转染到过表达水貂CD64基因的CRFK细胞系，再利用ADVa012核酸适配体对感染体系进行处理，经过分组试验，利用RNA-seq技术对各组样品中基因表达及信号通路差异进行分析。结果表明，pADV感染后，能明显影响细胞黏附、分化功能，激活关键抗病毒通路，并刺激细胞产生IL-1；用ADVa012适配体进行处理后，原有的表达模式发生了显著性改变，与病毒对抗的关键通路有明显改变，ADVa012适配体可能通过与病毒特异性结合起作用，并通过调节CAMs和钙信号通路来起到抑制病毒增殖的作用。