应用iPS技术探讨阵发型睡眠性血红蛋白尿症发病机制

阵发型睡眠性血红蛋白尿症(PNH)是以克隆性造血干细胞性异常，发病机制不明确，目前尚无有效的治疗方法。诱导型多能干细胞（ iPS)，具有胚胎干细胞的潜能，而且为不同疾病的发病机制研究、药物筛选以及个体化细胞替代治疗开辟了广阔的应用前景。本课题拟采用转基因技术建立同一患者来源的PIG-A /GPI-AP正常和PIG-A /GPI-AP异常的两类iPS。 将iPS体外诱导成为造血前体细胞以及成熟血细胞建立疾病体外实验研究模型。比较研究同一患者来源的PIG-A /GPI-AP正常和PIG-A /GPI-AP异常iPS体外衍生的造血前体细胞以及成熟血细胞的分子和生物学特征, 阐明骨髓衰竭综合征的发病机制，为其进一步药物筛选以及个体化细胞替代治疗奠定基础。

阵发型睡眠性血红蛋白尿症(PNH)是一种克隆性携带位于上X染色体PIG-A基因突变的异常造血干细胞（HSC）性增殖性疾病。 由于PIG-A基因突变而导致HSC及其成熟血细胞表面GPI锚蛋白和锚连蛋白缺乏，从而诱发补体介导的溶血性及骨髓衰竭等临床症状。尽管对发病机制进行了广泛的研究，但PIG-A基因突变的HSC克隆为何在PNH患者体内异常增殖并诱发疾病，至今尚未不明确。异基因骨髓移植是目前治愈PNH的唯一方法。但由于HSC来源以及免疫排斥等问题，严重影响了此方案的实施和疗效。利用基因转导技术建立具有胚胎干细胞的自我复制和向三胚层分化潜能的人源性诱导型多能干细胞（iPS)，不仅为用于不同疾病的发病机制研究的模型，而且为药物筛选以及个体化细胞替代治疗开辟了广阔的应用前景。然而诱导iPS细胞向具有成熟干细胞或体细胞特别是HSC，仍然是现阶段所面临和急需解决的问题。在自然基金的资助下，本课题组采用基因转导技术建立了多株PNH患者和健康自愿者来源的iPS 细胞系。.染色体核型分析表明所建iPS细胞具有正常核型。利用免疫组织化学染色，流式细胞仪分析及RT-PCR检测技术证明所建iPS细胞系包括源于健康自愿者和PNH患者均表达相同水平的多潜能标记，并具有体内体外分化成为三胚层的功能。进一步诱导分化实验表明，与正常iPS细胞系相比较，源于PNH患者的iPS细胞分化成为HSC（CD34 /CD31+）的功能明显减弱，提示在造血细胞分化成熟过程中，GPI-AP是却不可少的。此外，本研究成功建立简便、快速、无血清的单细胞层的方法诱导iPS细胞成为HSC，与以往方法相比较，其有效率提高500~1000倍，应用此方法能成功获取足以满足临床治疗剂量的HSC。由此方法获得的HSC类似于骨髓或脐带血来源的HSC，具有HSC的表型和形成红系、髓系、巨核细胞系和混合细胞系集落的功能，因此，此方法的建立为临床细胞治疗提供依据。