苹果双链RNA结合蛋白MdDRB调控miRNA合成和农艺性状的分子机理研究

双链RNA结合蛋白是miRNA生物合成必不可少的蛋白组分，本研究从苹果中克隆了双链RNA结合蛋白基因MdDRB，并获得了MdDRB转基因苹果愈伤组织和转基因苹果株系，在此基础上，计划利用MdDRB-GFP融合蛋白观察其亚细胞定位，通过电泳迁移率（EMSA）分析鉴定MdDRB蛋白与双链RNA的特异性结合，利用酵母双杂交、BiFC和PULL-DOWN证明MdDRB与核酸内切酶MdDCL1蛋白互作形成复合体。另外，利用转基因苹果材料，通过miRNA芯片的高通量分析和突变体的功能互补试验等鉴定MdDRB基因在miRNA合成中的生物学功能，最后通过分析转基因苹果的重要农艺性状、检测miRNA及其靶基因的表达水平、MdMIR172等重要miRNA基因的遗传转化等，阐明MdDRB蛋白调控苹果农艺性中的功能和分子机理，并获得具有特异农艺性状的转基因苹果资源。

尽管从果树中鉴定克隆了很多miRNA，但果树miRNAs生物合成的机理还知之甚少。我们知道，在模式植物中，双链RNA结合蛋白DRB在miRNA加工和成熟过程中起着重要作用，但其在果树中的功能、特别是重要农艺性状形成中的作用还不清楚。在本研究中，我们从苹果中克隆了一个双链RNA结合蛋白基因MdDRB，其在所有组织中都有表达，并被生长素和ABA等激素诱导。构建表达载体并遗传转化，获得了转基因苹果愈伤组织和植株，表型分析表明，该基因调控了苹果的miRNA合成、不定根发生、叶发育和树体生长习性（如树型和童期）等重要农艺性状。该基因编码双链RNA结合蛋白，MdDRB与拟南芥AtDCL1和苹果MdDCL1蛋白相互作用，调控miRNA的合成及其靶基因的表达，从而影响苹果的生长发育特性和重要农艺性状。芯片和表达分析发现MdDRB影响miR156和miR172等microRNA的合成和积累，因此鉴定了二者的功能。.我们从嘎拉苹果中克隆了miR156的编码基因Md-miR156h及其靶基因MdSPLs，进化树分析表明，18个MdSPL基因可能为miR156的靶基因。随后，我们构建了表达载体p35S:Md-miR156h并遗传转化拟南芥，在转基因植株中，Md-miR156h转录本和成熟miR156的积累水平均比对照高，而靶基因AtSPL9和AtSPL15的表达水平则明显降低。表型分析表明，转基因植株表现出童期延长、短角果和部分种子败育等表型。同样，我们也从嘎拉苹果中克隆了miR172的编码基因MdmiR172e及其靶基因MdAP2s，进化树分析表明，8个MdAP2s基因可能为miR172的靶基因，qRT-PCR和Western分析表明，miR172主要在转录水平调控MdAP2s等靶基因的表达。随后，我们构建了表达载体35S::MdmiR172e并遗传转化拟南芥，在转基因植株中，Md-miR72e转录本和成熟miR172的积累水平均比对照高。表型分析表明，转基因植株表现出童期缩短等表型。 .表达分析表明，MdDRB过量表达下调miR156的积累，而提高miR172的积累，因此，MdDRB通过调控miR156 和miR172合成，影响MdSPLs和MdAP2s等靶基因的表达水平，最终影响到苹果童期等重要农艺性状。