应用蛋白质组学研究癌蛋白SET在雄黄诱导的维甲酸耐药白血病细胞凋亡中的分子机制

已经明确雄黄（As4S4）治疗维甲酸耐药的急性早幼粒细胞白血病（APL）的良好疗效与其诱导的细胞凋亡密切相关。在前期研究中我们发现癌蛋白SET在As4S4诱导的APL耐药细胞株凋亡中显著下调甚至消失，国内外未见报道，提示癌蛋白SET可能处于多条信号传导通路的关键位置，SET可能是今后作用的药物靶点之一。本项目拟采用RNAi、构建真核重组表达质粒以及蛋白质组学、Western-blot、QRT-PCR等技术，研究SET表达质粒和SET siRNA表达载体转染的NB4-R1细胞间的差异蛋白质组学以及RNAi沉默SET后对As4S4诱导的NB4-R1细胞凋亡率、蛋白PP2A和PML-RARa融合蛋白表达的影响，并利用现代生物信息学方法分析差异蛋白质的功能和SET参与的信号传导通路及下游靶分子，研究寻找调节肿瘤细胞信号传导途径的关键靶蛋白及其作用机制，为肿瘤分子靶向治疗的药物筛选设计提供重要线索。

在前期比较蛋白质组学的研究中癌蛋白SET在雄黄(As4S4)诱导的急性早幼粒细胞白血病(APL)维甲酸耐药株NB4-R1细胞凋亡中发生显著下调甚至消失，提示SET可能处于多条信号传导通路的关键位置。本项目研究结果显示，首先成功构建SET RNA干扰慢病毒载体和重组pEGFP-N1-3FLAG-SET过表达载体。发现在As4S4诱导的NB4-R1细胞凋亡过程中，伴随着SET mRNA水平和蛋白水平上的表达降低，并且通过iRNA敲除SET基因后减少了caspase 8前体蛋白，激活caspase 8，使As4S4诱导的细胞凋亡比率增加；而SET过表达使细胞存活率有所恢复，表明As4S4通过降解SET蛋白诱导NB4-R1细胞凋亡。而敲除SET基因和As4S4的药物作用对于上调PP2A表达、恢复其活性具有协同效应。相反，SET过表达则导致PP2A下调，但As4S4处理后的NB4-R1细胞不出现这种下调效应，也就是说As4S4对于SET蛋白的表达及下游通路具有拮抗效应。SET RNAi沉默造成PML-RARa融合蛋白表达下调，这种下调效应在施加As4S4作用后进一步增强，因此敲除SET基因和As4S4的药物作用对于降解融合蛋白PML-RARa具有协同效应。相反，SET过表达则导致融合蛋白PML-RARa上调，但As4S4处理后的NB4-R1细胞不出现这种上调效应。As4S4通过抑制SET蛋白表达进而导致PML-RARa融合蛋白的降解，促进APL细胞凋亡。此外，As4S4作用于NB4-R1细胞后引起Bcl-2、Bax、caspase3表达水平改变。因悬浮细胞无论转染质粒还是慢病毒载体效率均相对较低，多次重复反复优化并尝试了电转染，仍无法收集足够多阳性细胞行比较蛋白质组学研究，对此我们适当调整了研究策略。本项目总体上实现预期目标，证实了立项时设想的可能的信号传导通路。癌蛋白SET在APL发生发展和雄黄诱导的细胞凋亡中扮演关键角色，As4S4—SET—PP2A和As4S4—SET—PML-RARa是雄黄诱导APL细胞凋亡机制中的两条重要作用通路，其下游进一步通过激活caspase 3和caspase 8，增强Bax表达，同时抑制bcl-2，促进肿瘤细胞凋亡。应用PP2A激活剂或干扰SET-PP2A间相互作用（如PP2Ac过表达、SET敲除）可能是APL今后治疗的崭新策略。