呼吸道合胞病毒M2-1蛋白参与宿主基因转录调控促进病毒基因组复制的作用机制研究

Respiratory syncytial virus (RSV) is the most important respiratory pathogen in the world, but its pathogenesis is still not fully understood. M2-1 is one of the RSV structural proteins, and previous studies have shown that it has the a viral genome transcriptional anti-terminating function. In recent years, it has been found that M2-1 can enter the nucleus of the host cell after RSV infection, accompanied by the increase of RSV genome replication, suggesting that M2-1 is involved in the transcriptional regulation of the host gene and can promote viral genome replication. Our previous study have also shown that M2-1 promotes cell and virus proliferation. Based on the previous work, we intend to preliminarily explore the mechanism of M2-1 regulating cell gene transcription and viral genome replication by analyzing the differences of M2-1 binding RNA and protein profiles before and after nuclear import of M2-1 through RIP, CO-IP combined with high-throughput sequencing and proteomics technology. We intend to preliminarily explore the effect of M2-1 on the pathogenicity of the virus by analyzing the changes of viral proliferation and cell damage of the M2-1 function-deficient virus strain which constructed basing on the existing RSV reverse genetic system, and blocking the M2-1 important signaling pathway. The successful implementation of this project is of great significance for the in-depth understanding of RSV infection and pathogenic mechanism, and may provide new targets and ideas for the development of RSV therapeutic drugs.

呼吸道合胞病毒（RSV）是全球最重要的呼吸道病原体，但其致病机制仍未完全明晰。M2-1是RSV结构蛋白之一，过往研究表明其具有病毒基因组转录抗终止功能。近年来发现RSV感染后，M2-1可进入宿主细胞核内，并伴有RSV基因组复制的增加，提示M2-1参与宿主基因转录调控并可促进病毒基因组复制。前期我们已经就M2-1促进细胞和病毒增殖进行了初步研究。本研究拟在前期基础上，通过RIP、CO-IP结合高通量测序及蛋白质组学技术，分析入核前后M2-1结合RNA图谱和蛋白图谱差异，初步探索M2-1调控细胞基因转录及病毒复制机制；通过已有的RSV反向遗传系统构建M2-1功能缺失病毒株及通过阻断M2-1重要信号通路分析病毒增殖和细胞损伤变化，初步探讨M2-1对病毒致病性的影响。本项目的顺利开展对深入了解RSV感染与致病机制具有重要意义，同时可能为RSV治疗药物研发提供新靶点、新思路。

呼吸道合胞病毒（RSV）是全球最重要的呼吸道病原体，但其致病机制仍未完全明晰。M2-1是RSV结构蛋白之一，过往研究表明其具有病毒基因组转录抗终止功能。近年来发现RSV感染后，M2-1可进入宿主细胞核内，并伴有RSV基因组复制的增加，提示M2-1参与宿主基因转录调控并可促进病毒基因组复制。本项目（1）构建M2-1蛋白过表达载体：通过免疫荧光检测M2-1蛋白的表达，为研究M2-1蛋白功能奠定基础。（2）制备M2-1多克隆抗体：通过对M2-1蛋白原核表达并纯化，将所获蛋白进行免疫，得到兔源anti-M2-1多克隆抗体，为后续的CO-IP提供材料储备。（3）CO-IP联合质谱分析与M2-1互作蛋白：通过CO-IP获得与M2-1相互作用的蛋白，将所获蛋白进行LC-MS/MS分析。通过多肽片段的丰度、评分等综合分析，筛选得到81个蛋白。进一步进行GO注释，并从蛋白在细胞内参与的生物过程、蛋白的分子功能、在细胞中定位等三个方向进行分析，发现M2-1互作蛋白参与细胞的能量代谢、DNA/RNA调控这两类比较多，由此我们认为M2-1在细胞中可能调控宿主的能量代谢以及RNA转录，为我们的后续研究指明了方向。（4）构建呼吸道合胞病毒反向遗传系统：该系统可以拯救具有感染性的呼吸道合胞病毒，且基因组上所有基因均可进行改造，并用于后续的动物实验。另外，为了减少其他蛋白的干扰，构建了仅具有M2-1蛋白的迷你基因组，并用于后续研究。此外，我们在对RSV进行的流行病学调查研究同时发现， 广州地区RSV在我们检测的18种病原体中其感染率最高；而按年龄分组发现RSV在5岁以下儿童中感染率最高，且感染趋势随着年龄的升高而下降，并伴有一定程度的共感染；季节的转换也导致了RSV在广州地区的流行。