内生真菌Berkleasmium sp. Dzf12中螺二萘Palmarumycin C13生物合成关键步骤研究

Spirobisnaphthalenes are a class of fungal metabolites with highly oxygenated structures, presumably formed by condensation of two molecules of naphthalenes via a spiro carbon. They are with complex and diverse structures, and display broad spectrum of activities such as antitumor, and antimicrobial. Currently, the biosynthetic pathway of spirobisnaphthalenes is incomplete, and the biosynthetic genes is unclear. In this project, we aim to investigate the biosynthesis of palmarumycin C13 from the endophytic fungus Berkleasmium sp. Dzf12 based on our previous work. After prediction of the biosynthetic gene cluster for spirobisnaphthalenes by bioinformatics analysis, we will study the gene functions by gene knockout, complementation, transcription analysis, and heterologous expression of the targeted genes, for the first time. By cloning the genes related to the dimerization of monomeric naphthalenes and spiroketal formation, heterologous expression and purification of the recombinant protein, we will study the substrate-specificity and key functional domain of these enzymes. This will unveil the biosynthetic mechanism of the “homoannular dioxygen”- type of spiroketal for the first time, should enrich our knowledge on the biosynthesis of spiroketal, and will open the door to efficient generation of stereospecific structures that are otherwise hard to synthesize chemically.

螺二萘是一类由两分子萘环通过螺碳原子聚合而成、并且高度氧化的真菌次生代谢产物。它们具有复杂而独特的结构，具有抗肿瘤、抗菌等多种生物活性。目前螺二萘的生物合成途径不完整、合成基因不清楚。本项目将在前期研究基础上，拟开展内生真菌Berkleasmium sp. Dzf12中螺二萘Palmarumycin C13的生物合成研究，重点解析萘环单体氧化、二聚这些关键步骤。通过生物信息学预测合成基因簇，采用基因敲除、遗传互补、转录分析、体外表达等分子生物学手段，将首次揭示螺二萘生物合成基因及其功能；通过克隆二聚化相关酶（螺缩酮合成酶）基因，进行异源表达并纯化后，研究酶的底物特异性和关键功能域。该研究将首次揭示同环二氧型螺缩酮生物合成的独特机制，丰富我们对螺缩酮生物合成的认识，为高效生产那些通过化学合成难以实现的、立体特异的螺缩酮开辟一条新途径。

螺二萘是一类由两分子萘环通过螺碳原子聚合而成、并且高度氧化的真菌次生代谢产物。它们具有复杂而独特的结构，具有抗肿瘤、抗菌等多种生物活性。目前螺二萘的生物合成途径不完整、合成基因不清楚。本项目对内生真菌Berkleasmium sp. Dzf12中螺二萘Palmarumycin C13等进行了生物合成研究。采用三代测序技术对真菌进行了全基因组测序及生物信息学分析，结合转录组分析，鉴定了内生真菌Dzf12中螺二萘的生物合成基因簇，由两个相隔很远的基因簇组成，即1,8-二羟基萘合成基因簇以及螺二萘合成基因簇；通过基因敲除、异源表达（米曲霉、酵母和大肠杆菌）、底物饲喂等，重点对螺二萘簇中三个关键基因（PalA~C）进行了功能验证，首次揭示了各基因的功能。其中，PalA 能特异催化1,8-二羟基萘的二聚、环氧化和螺环化，PalB负责萘环羟基化；PalC负责羰基还原与羟基氧化；通过对代谢中间体的结构分析和鉴定，推导了palmarumycin类螺二萘的生物合成途径；通过对关键前体进行化学合成和体外反应，阐明了关键的二聚化步骤，并初步揭示了该螺缩酮合成酶的催化机制。本项目首次阐明了螺二萘生物合成基因及其功能；揭示了同环二氧型螺缩酮生物合成的独特机制，丰富我们对螺缩酮生物合成的认识，为通过化学--酶法高效生产那些通过化学合成难以实现的、立体特异的螺缩酮奠定了基础。