大黄鱼依赖MyD88的Toll样受体信号传导途径研究

髓样分化因子88（MyD88）作为Toll样受体（TLRs）诱导免疫途径的中枢分子，起着免疫信号传导与激活的作用。本课题拟克隆大黄鱼与MyD88密切相关的TLRs途径中关键免疫因子（IRAK, IRF, IL等）；体外表达MyD88，并采用融合蛋白下拉、质谱鉴定寻找与MyD88相互作用的蛋白质，扩增新发现的与MyD88相互作用蛋白的ORF序列，采用酵母双杂交技术进行验证；采用real-time PCR、Westernblot、ELISA等技术检测大黄鱼在受到免疫刺激后TLRs，关键中间递体分子和免疫效应因子（TNF-α,ILs,IFN等）的表达特征及重要免疫指标的变化，确定大黄鱼依赖MyD88的TLRs信号传导途径，并阐释该途径对免疫应答反应的诱导和激活作用；解析依赖MyD88的TLRs途径在大黄鱼免疫反应中的作用机制，丰富海水鱼类的免疫学知识。

以MyD88为中心，围绕TLR途径中其介导的受体、递体、调节子及效应因子在大黄鱼免疫反应中的特征进行研究，结果如下：.鉴定了受体TLR1/2/21的分子结构，均具保守的LRR和TIR结构域；TLR2定位于细胞膜及细胞质；虽然LPS、polyI:C及弧菌刺激均会诱导主要免疫组织中这3个基因表达量上升，但在大黄鱼LCK细胞系，TLR1/2可能在识别鞭毛蛋白及肽聚糖过程中具有重要作用。 .免疫信号传导过程中，这3个受体可能与MyD88结合，然后通过IRAK4进行信号传导，它含DD和STKc结构域；LPS和polyI:C可以诱导其在脾脏和血液中增加。IRF3基因含11个外显子及10个内含子，N端有一个IRF3结构域，在肝脏中表达量较高；LPS和polyI:C刺激可以诱导脾脏、血液和肝脏中IRF3表达增加。IRF7基因含有9个外显子，8个内含子，包含典型的IRF及IRF3结构域。主要表达于鳃，受到polyI:C的刺激后，表达量显著上调。获得了I型干扰素基因的序列，含5个外显子，4个内含子，N端含有20aa的信号肽，一个IFabd结构域，在血细胞中表达量最高；但polyI:C刺激不能诱导IFN转录增加。IL8基因含4个外显子，3个内含子，编码94个aa，包含一个SCY结构域；纯化得到了可溶性大肠杆菌IL8表达产物，重组IL8刺激大黄鱼LCK细胞系，可以诱导O2-˙增加，并在抗病能力不同的大黄鱼品系中获得了5个SNP位点； .除MyD88外，其他因子也可能参与这几个TLR的信号传递；其中，LPS及polyI:C物均可诱导IRF3/7表达增加，但鱼类的抗菌及抗病毒分子机制可能不及哺乳动物专一，提示鱼类的TLR信号传递机制可能较为复杂。.在前期获得MyD88全长序列的基础上，完成了其在大肠杆菌中的重组表达，获得了纯化的可溶性表达产物；采用GST下拉技术，得到了2个与之特异结合蛋白的条带，采用离子阱质谱鉴定到10个蛋白质，经过生物信息学分析，对其中4个可能与之相互作用的蛋白质进行了克隆，采用免疫共沉淀，在大黄鱼LCK细胞系中验证了其与MyD88的相互作用。.对大黄鱼转录组进行了深度测序；实验室建立了以大黄鱼CLK、EPC及模式鱼和哺乳动物细胞系为基础的亚细胞定位、过表达、病原感染、免疫共沉淀的技术平台。下一步拟对鱼类特有TLR受体的免疫识别及信号传导机制深入研究。