血红素加氧酶-1在诱导性多能干细胞促进糖尿病创面愈合中的作用及机制研究

Induced pluripotent stem cells (iPS) provide a promising platform for the treatment of diseases. Delayed wound healing and impaired tissue regeneration were the most common complications in diabetes, often throwing up severe challenges in the clinical therapy. Our previous studies indicted that iPS cells placed into the wound bed, accelerated the cutaneous wound healing, parralled by increased heme oxygenase-1(HO-1) expression in diabetic mice. Another notable finding in our study is that when the expression of HO-1 in iPS cells was inhibited by HO-1 siRNA transfection, wound healing was delayed significantly. Based on our previous studies, we tested the hypothesis that HO-1 plays a key role in iPS accelaerating wound healing in diabetes. We study the protective effects of HO-1 in iPS promoted wound healing by modifying the HO-1 gene (over-expression and knock-down)in iPS cells prior to their transplantation onto dabetic cutaneous wound. In vitro experiment, we investigate the iPS cellular function changes by HO-1 knock down and overexpression both in normal and high glucose culture condition. Further characterization and better understanding the protective function of HO-1 in iPS indued wound healing could provid a basis for the therapeutic application of iPS in wound healing. Finally, we provide evidence that the HO-1 could be a target when devoloping iPS-based cell therapies in diabetic wound healing.

诱导性多能干细胞（iPS）在多种疾病治疗中显示出巨大应用潜力。糖尿病创面难愈目前仍是临床常见的棘手问题。申请者前期研究发现，iPS细胞在糖尿病小鼠皮肤创面局部点滴，明显促进创面愈合，并且提示HO-1在其中发挥重要作用。因此本课题假设：HO-1是介导iPS细胞促进糖尿病创面愈合的关键调控分子。通过抑制或过表达iPS细胞中HO-1，在整体水平上研究HO-1在iPS细胞促进糖尿病创面愈合中的保护作用。在体外正常或高糖培养的iPS细胞中，研究HO-1对iPS细胞功能的影响，深入探讨HO-1具有在高糖环境中保护iPS细胞功能的作用。本项目的科学意义在于证实HO-1是介导iPS细胞促进糖尿病皮肤创面愈合的关键保护分子，这将为iPS细胞在糖尿病创面愈合中的应用开辟新思路；为以HO-1为靶点，提高iPS细胞促进创面愈合治疗效果提供理论和实验依据。

近年来，随着细胞治疗的深入研究，诱导性多能干细胞（iPS）在多种疾病治疗中显示出巨大应用潜力。本课题组采用与创面局部点滴iPS细胞的方法，研究iPS细胞对糖尿病小鼠皮肤创面愈合的治疗作用并探讨其机制。利用腹腔注射链脲佐菌素（STZ） 建立小鼠1型糖尿病模型并在皮肤表面造局部损伤创面，结果发现：iPS细胞在糖尿病小鼠皮肤创面局部点滴应用，明显促进其创面的愈合，促进创面边缘表皮增生修复，促进修复早期皮下胶原的沉积，促进创面修复过程中的血管新生。与对照组比较，iPS细胞治疗组糖尿病小鼠创面组织中多个促血管新生因子及受体表达上调，包括血管内皮细胞生长因子 （VEGF），表皮生长因子 （EGF），转化生长因子 （TGFβ1）胰岛素样生长因子(IGF-1)，碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)及受体。为了进一步阐明HO-1在iPS细胞促糖尿病创面愈合中的作用机制，体外对iPS细胞的血红素加氧酶（HO-1）进行干扰后，iPS上述的治疗效果及促血管新生因子及受体表达的效果明显降低，这表明HO-1是介导iPS细胞促进糖尿病皮肤创面愈合的关键保护分子。因此，本研究对iPS局部创面点滴应用进行了长期（3个月）的观察，并未发现局部点滴应用的iPS细胞具有致瘤性。 .本研究在高糖培养iPS过程中发现：高糖容易使iPS细胞发生分化失去其干细胞特性。因为课题组在前期研究中发现iPS细胞在皮肤局部应用显著上调创面组织中VCAM-1的mRNA和蛋白水平表达。因此，我们将部分实验进行了调整，采用小鼠肾小球毛细血管内皮细胞与iPS共培养技术，分别干扰和过表达VCAM-1；进一步应用siRNA干扰iPS细胞整合素α4β1的表达或者用可溶性VCAM-1封闭iPS细胞整合素α4β1的功能。探讨VCAM-1/整合素α4β1对iPS细胞粘附内皮细胞和跨内皮迁移能力的影响。实验结果表明：肾小球毛细血管内皮细胞过表达VCAM-1后，iPS细胞粘附在血管内皮细胞的数量以及跨内皮细胞迁移的数量明显增多；shRNA 干扰内皮细胞VCAM-1表达后，iPS细胞粘附和迁移能力显著下降。另外，干扰iPS细胞整合素α4/ β1的表达或者用s-VCAM-1预处理iPS细胞，均引起iPS与内皮细胞的粘附和跨内皮细胞迁移的数量显著减少。提示VCAM-1是介导iPS细胞粘附和跨血管内皮细胞迁移的重要粘附分子。.