上调反刍动物Ghrelin的内皮素受体亚型研究

Ghrelin is an endogenous ligand for growth hormone secretagogue receptors (GHS-R) and has a serial of biological effects, such as stimulation of growth hormone release and regulation of appetite. Our previous studies have shown exogenous endothelin (ET) can increase plasma ghrelin levels in ruminants, but the ET receptor subtypes, ET-A and ET-B, which mediated this effect are unclear. The project aims to (1) clarify the ET receptor subtype mediating ghrelin secretion using the specific antagonists for each ET receptor subtype; (2) to investigate the tissue localizations of ghrelin cells and ET-A and ET-B receptors by immunohistochemical techniques in Xinjiang fine-wool sheep; and (3) to explore whether ET-A and/or ET-B receptors are located on ghrelin cells to find the possibility of ET physiologically regulation of ghrelin secretion. We hope that the results from this project can contribute to explain the regulatory mechanism of ghrelin secretion as well as appetite and growth in ruminants.

Ghrelin是生长激素促泌素受体(GHS-R)的内源性配体，具有促进生长激素释放，调节食欲等广泛的生物学作用。我们在反刍动物研究已经证明外源性内皮素（ET）能够上调血浆Ghrelin 水平，但是介导该过程的内皮素受体亚型尚不清楚。本项目将用内皮素受体亚型ET-A和ET-B的高特异性阻断剂，探究介导内皮素上调羊Ghrelin分泌的内皮素受体亚型。其次，采用免疫组化技术，研究新疆细毛羊Ghrelin内分泌细胞、ET-A和ET-B受体在机体各组织的分布，并且探查在Ghrelin内分泌细胞上ET-A和ET-B受体存在的可能性，从组织学角度探明内皮素生理性上调Ghrelin分泌的可能性。最后，研究内皮素增加Ghrelin分泌的组织特异性。期望通过本项目研究为反刍动物Ghrelin调控机制提供理论依据，奠定调控动物食欲和生长实践的生理学基础。

我们之前的研究证明内皮素-1（ET-1）和内皮素-3（ET-3）均可升高反刍动物生长激素释放肽(Ghrelin)和生长激素（GH）水平，但介导其作用受体亚型尚不清楚。本研究用多肽固相合成法合成了羊G-蛋白耦联7次跨膜的ET-A和ET-B受体膜外多肽片段、羊酰基化Ghrelin（oGhrelin）和生长激素释放肽-6（GHRP-6，用于抗体特异性检测）。以羊ET-A和ET-B受体膜外多肽片段作为半抗原，在豚鼠和鸡制备多克隆抗体，但经放射免疫法检测制备的抗血清以1:5000稀释后其同抗原结合率（B/T）均≤ 0.08，说明这两种抗血清无法用于在羊各组织定位ET受体。通过在体试验证明合成的oGhrelin具有生物学活性。为了确定介导ET促进Ghrelin和GH分泌的ET受体亚型，采用完全拉丁方试验设计给8只去势牛一次性静脉注射ET-3 (0.1, 0.4, 0.7, 1.0 μg/kg BW)、IRL1620 (ET-B受体特异性激动剂，2.0 μg/kg BW)、[D-Lys3]-GHRP-6 (20.0 μg/kg BW)以及ET-3(1.0 μg/kg BW)同 [D-Lys3]-GHRP-6 (20.0 μg/kg BW)联合用药。结果显示，同对照组相比ET-3剂量依赖性升高牛血浆Ghrelin、GH、葡萄糖和NEFA水平（P ＜ 0.05）；IRL 1620具有同ET-3相同的作用（P ＞ 0.05）；GHS-R受体阻断剂 [D-Lys3]-GHRP-6能够阻断ET-3导致的GH水平升高（P ＜ 0.05），但对其它指标无影响（P ＞ 0.05）。用兔抗酰基化Ghrelin抗体在羊皱胃（特别是胃底腺底部）定位到Ghrelin免疫阳性细胞；用商业化兔抗ET-A和ET-B受体抗体，初步在绵羊皱胃胃底弥散性定位到ET-A和ET-B受体免疫活性物质，尤其是在胃底腺颈部和底部腺腔以及黏膜肌层染色较深，提示ET及其受体可能参与胃底腺外分泌细胞和内分泌细胞分泌活动的调节，但尚不能准确判断是否在皱胃Ghrelin的内分泌细胞上具有ET受体的分布。本研究结果提示，ET-3导致的反刍动物内源性增高的Ghrelin促进GH的分泌，ET-B受体参与介导ET-3促进Ghrelin和GH分泌的作用，并且ET及其受体系统也可能参与反刍动物能量代谢的调节。