同种异体髓核细胞联合细胞支架移植治疗椎间盘退行性变的实验研究

Intervertebral disc degeneration is the pathological cause of spinal degenerative diseases. Previous studies showed autograft of nucleus pulposus cells can inhibit or reverse disc degeneration. However, the harvest of nucleus pulposus cells for autograft will lead to disc degeneration. Previous studies of our group show that disc cell apoptosis and the decrease of cell number in nucleus pulposus is one of the main cause of disc degeneration. The cells in intervertebral disc express FasL, and intervertebral disc may be immune privileged. We presume that allograft of nucleus pulposus cells can survive and inhibit or reverse disc degeneration. To test this hypothosis, we plan to establish the rabbit disc degeneration model by annulus fibrosus punture and expiration of nucleus pulposus. And then transplant the allograft nucleus pulposus cells,scaffold and cytokines into the degenerative disc. After 4, 8 and 16 weeks, X ray film, MRI and HE staining is used to evaluate disc degeneration; content of proteoglycan and type Ⅱcollagen in the disc is measured; CD4、CD5 and MHC is used to test immunological rejection; Tunel is used to evaluated cell apoptosis and electronic microscopy is used to observe the allograft cells and the scaffold. This project will try to find new seed cells for tissue engineer of intervertebral disc degeneration treatment, and provide new prospect and new methods for the treatment of intervertebral disc degeneration.

椎间盘退变是脊柱退变性疾病的病理基础。文献报道自体髓核细胞移植可以抑制甚至逆转椎间盘退变。但是，自体髓核细胞的取材势必造成相应椎间盘本身的退变。本课题组的前期研究发现椎间盘细胞凋亡、髓核中活细胞减少是椎间盘退变的重要原因；椎间盘细胞表达FasL，可能为免疫豁免器官。我们推测同种异体髓核细胞能够在椎间盘中存活并发挥功能，起到抑制或逆转椎间盘退变的作用。我们拟通过穿刺椎间盘和抽吸髓核组织两种方法建立兔椎间盘退变模型，再向椎间盘中移植体外培养扩增、标记的异体髓核细胞和细胞支架、细胞因子，4、8、16周后用X线片、核磁共振和HE染色评价椎间盘的退变以及移植细胞的分布，测量细胞外基质中蛋白多糖和Ⅱ型胶原的含量变化,通过及检测CD4、CD5和MHC批评价免疫排斥，用Tunel检测细胞凋亡并用扫描电镜观察移植的细胞和支架。本课题将探索椎间盘退变组织工程治疗的新种子细胞，为椎间盘退变的治疗提供新思路和方法

背景：椎间盘退变是腰椎间盘突出症、颈椎间盘突出症等脊柱退变性疾病的病理基础。国内外对椎间盘退变性疾病的生物学治疗很重视。 ..主要研究内容：首先，我们用穿刺椎间盘和抽吸髓核组织两种不同方法方法建立兔椎间盘退变模型。再将兔髓核细胞进行体外单层培养、立体培养和标记，然后向退变的椎间盘中移植体外立体培养、标记的异体髓核细胞和细胞因子。 .. 重要结果：穿刺椎间盘建立的兔椎间盘退变模型中保留大部分髓核组织，更接近临床中退变的情形。CFDA-SE可以很好的标记髓核细胞并且不影响髓核细胞的功能；通过HE染色、透射电镜、扫描电镜、RT-PCR、Western-Blot、Tunel、X线片、核磁共振等方法发现体外胶原蛋白支架立体培养的髓核细胞能够更好的维持其表型和功能，TGF -β1、BMP-2可以提高髓核细胞合成细胞外基质功能，同种异体髓核细胞联合细胞支架、细胞因子移植到退变椎间盘后可以修复退变的椎间盘。对于退变时间越长、退变程度越严重的椎间盘，移植同种异体髓核细胞、胶原支架和细胞因子修复椎间盘退变效果越差。佩戴支具有促进髓核细胞对椎间盘的修复作用。用CD4、CD5 的免疫组化在移植细胞周围以及附近淋巴结没有发现免疫排斥的迹象。 ..关键数据：CFDA-SE通过被动运输穿透细胞膜进入髓核细胞，和髓核细胞共同孵育30分钟标记的髓核细胞达93%。兔髓核细胞在胶原支架、藻酸盐微球、壳聚糖、纤维蛋白明胶、明胶-硫酸软骨素三维培养以及单层培养的细胞增殖比率为1.52:1.34:1.31:1.25:1.18:1；表达2型胶原纤维RNA比率为1.49:1.25:1.22:1.18:1.13:1；表达蛋白聚糖RNA比率为1.62:1.41:1.34:1.31:1.19:1。在胶原支架的三维髓核细胞培养中加入生长因子，分别加入TGF- ß1、BMP-2、TGF- ß3、BMP-7，GDF-5和普通立体培养时髓核细胞增殖比率为1.45:1.37:1.29:1.28:1.21:1；表达2型胶原纤维RNA比率为1.63:1.57:1.35:1.31:1.18:1；表达蛋白聚糖RNA比率为1.81:1.62:1.41:1.33:1.25:1。 ..科学意义：本研究在动物实验中探索总结椎间盘退变的组织工程程学治疗的技术和方法，为椎间盘退变的临床生物学治疗奠定基础。