Oct4通过诱导去分化维持CK19+双表型肝细胞癌的机制研究

Dedifferentiation is a cellular process in which terminally differentiated cells revert to an earlier developmental stage or other types of cells, resulting in a relatively low state of differentiation from a high differentiated state. Dual-phenotype hepatocellular carcinoma (DPHCC) can express both hepatocellular (Hep Par-1/AFP) and biliary (CK19/CA19-9) biomarkers and shows the characteristics of hepatic progenitor cells with highly postoperative recurrent risk. Oct4 is a transcription factor which plays a key role in embryonic development and stem cell pluripotency. Aberrant expression of this gene in adult tissues is associated with tumorigenesis. We previously found that Oct4 maintained the stem cell-like properties of tumor-initiating cells. However, it is not clear whether Oct4 contributes to the maintenance of DPHCC especially in the process of cancer cell dedifferentiation. Here we aim to investigate the molecular mechanism of Oct4 in regulation CK19+ tumor-initiating cells and elucidate its role in DPHCC progression, which providing new thoughts for diagnosis and treatment of HCC.

去分化是指在某些特殊情况下已经分化成某种特异、稳定类型的成熟细胞逆转为未分化状态或其它类型细胞、从一种高分化状态返祖为相对低分化状态的过程。双表型肝细胞癌（DPHCC）是指同时表达肝细胞癌标志物及胆管癌标志物、具有肝癌前体细胞特征及高复发风险的一类HCC亚型。Oct4是在胚胎发育及维持干细胞多向潜能中重要的转录因子，其表达异常与多种肿瘤发生密切相关，我们的前期研究结果表明Oct4的高表达可维持肝癌前体细胞的干细胞活性，但Oct4对具有前体细胞特征的DPHCC的调控作用是否与其诱导的肿瘤细胞去分化相关目前仍不清楚。本课题将进一步明确Oct4对正常肝前体细胞和以CK19+为代表的肝癌前体细胞分化水平及干细胞特性的影响，利用可视化原位肝癌动物模型，研究Oct4对去分化的调控在DPHCC发生发展中的作用，并在体内外探讨相关分子机制，深化对Oct4与DPHCC功能的认识，为肝癌防治提供新思路。

本项目利用高通量miRNA芯片筛选、结合生物信息学分析及经典的分子生物学技术验证，筛选鉴定出在双表型肝细胞癌（DPHCC）中表达显著降低的微小核糖核酸miR-101-3p，并在48对DPHCC癌及癌旁石蜡组织中进行大样本验证；在多种肝癌细胞系中外转miR-101-3p的mimics后证实了CK19表达水平的降低，我们发现miR-101-3p可以通过靶向核转录因子POU2F1（ OCT1）的3’-UTR区下调OCT1的表达，而CK19也同时出现相应的表达降低，这一现象在一系列正常肝细胞和肝癌细胞系中得到了验证；ChIP实验证实 OCT1与CK19两者间有相互结合作用，且过表达或干扰OCT1可以调控CK19的表达；利用216例肝癌临床样本、临床病理信息和患者预后资料，我们证实了相较于 CK19-的肝癌病例， CK19+的DPHCC患者的无瘤生存期及总生存期更短，miR-101-3p 在CK19+肝癌病人组织中表达更低，而OCT1则与miR-101-3p的表达情况成反比；分析发现两者表达水平与患者预后相关，低表达miR-101-3p及高表达OCT1的病人生存期更短。.功能研究方面，目前我们已经构建及包装完成了针对miR-101-3p及OCT1的高低表达腺病毒及慢病毒并成功构建了DPHCC人源肿瘤异种移植（PDX）小鼠模型，下一步计划是利用这些载体工具研究miR-101-3p及OCT1对肝癌细胞恶性表型的影响及其用于肝癌治疗的可行性，着重关注两者对肿瘤细胞由肝细胞表型向胆管细胞表型转化过程中起到的作用，拟检测贴壁与悬浮培养的肝癌细胞系/原代肝癌细胞中miR-101-3p、OCT1与干性相关基因、胆系相关基因等的表达变化；最终通过3D培养动态观察两者对肝癌细胞系/原代肝癌细胞及裸鼠肝原位种植瘤的组织形态学影响。.目前已有结果提示miR-101-3p不但可能作为肝癌患者预后判定的生物标志物，还可能作为靶向OCT1及CK19治疗肝癌的重要工具，具有较好的科学技术价值和应用前景。后续细胞及动物实验正在进行中，并计划拟从新鲜肝癌组织建立一个高表达CK19的DPHCC细胞系，为治疗靶点验证提供研究工具，并申报国家发明专利。项目执行期间，培养研究生1名，课题组发表标注受本课题资助的论文1篇，目前正在对本项目的创新点进行总结，准备投稿有国际影响力的高质量杂志。