NaCl胁迫下Ca2+调控大豆芽菜富集GABA机理研究

Abstract: Ca2+ treatment could not only remove the NaCl stress on soybean sprout, but also increase the accumulation of γ-aminobutyric acid (GABA). However, the regulation mechanism in this procedure is still not clear. In this project, Ca2+ treatment on physiological and biochemical metabolism, glutamate decarboxylase (GAD), diamine oxidase (DAO) and 4-aminobutyraldehyde dehydrogenase (AMADH) activity as well as GABA content in germinating soybean under NaCl stress will be investigated. The research will ascertain the dynamic balance mechanism of GABA shunt and polyamine degradation pathway on GABA accumulation using the specific inhibitor of AMADH. By investigating relationships between key enzymes gene expression and their activity, proteome change and GABA accumulation, the molecular mechanism of Ca2+ treatment regulating accumulation of GABA in germinating soybean under NaCl stress will be revealed clearly.

Ca2+处理既能解除NaCl对大豆芽菜生长的抑制作用，又能促进其富集γ-氨基丁酸（GABA），但其机理尚不清楚。针对这一科学问题，本项目研究NaCl胁迫下Ca2+处理对大豆芽菜主要的生理代谢、合成GABA的限速酶—谷氨酸脱羧酶（GAD）、二胺氧化酶（DAO）和4-氨基丁醛脱氢酶（AMADH）活性与GABA含量的影响；用AMADH的专性抑制剂阻断多胺降解途径，分析GABA合成的底物—谷氨酸（Glu）、多胺和4-氨基丁醛降解量及GABA富集量的变化，探索Ca2+调节GABA支路与多胺降解途径形成GABA的动态平衡机制；探明合成GABA的限速酶基因表达及其活性、蛋白质组变化与GABA富集之间的关系，从分子水平上揭示NaCl胁迫下Ca2+调控大豆芽菜富集GABA的机理。

大豆芽菜在NaCl胁迫下大量合成对人体具有降血压、缓解压力等功能的γ-氨基丁酸（GABA），其中Ca2+扮演着重要的角色。在芽菜培育时添加NaCl和CaCl2，获得了有利于芽菜富集GABA的培养条件。在NaCl和CaCl2联合处理下研究了大豆芽菜生理生化变化，NaCl显著抑制芽菜生长，CaCl2通过增加超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）等活力来缓解NaCl的胁迫作用。NaCl胁迫下，发芽大豆子叶和胚中谷氨酸脱羧酶（GAD）、二胺氧化酶（DAO）、多胺氧化酶（PAO）和氨基醛脱氢酶（AMADH）活力均提高，且胚中GAD和DAO活力显著高于子叶。筛选得到1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC）为多胺降解途径中关键酶氨基醛脱氢酶（AMADH）的专一抑制剂，发现1mM的EDC可有效抑制AMADH活性，同时不影响其他关键酶活性。通过抑制AMADH活力阻遏多胺降解途径对GABA生成的贡献，发现NaCl胁迫下子叶和胚中GABA含量分别下降31.5%和33.5%；NaCl联合CaCl2处理时，子叶中GABA含量分别降低17.0 %和20.5%。说明NaCl胁迫下多胺降解途径对GABA富集的贡献约为30%，而添加Ca2+后，增强了GABA支路的作用而降低了多胺降解途径的贡献。NaCl胁迫下，大豆芽菜子叶和胚中GAD、DAO和AMADH表达显著上调。NaCl联合CaCl2处理，子叶中GAD表达量无显著变化，DAO和AMADH表达显著下降，胚中GAD、DAO和AMADH表达均显著下降。因此，NaCl胁迫提高GABA合成酶活力，积累GABA；NaCl联合CaCl2处理下，GAD活力的提高由Ca2+刺激所致，与其基因表达无关。CaCl2显著抑制多胺降解途径代谢酶活力及基因表达，降低其对GABA贡献率。NaCl联合 CaCl2处理下，大豆芽菜中参与Glu代谢的谷氨酰胺合成酶PR-2以及谷氨酰胺合成酶前体的丰度显著下降；参与PAs代谢的两个S-腺苷甲硫氨酸合成酶以及甲硫氨酸合成酶经CaCl2处理后其丰度增加；NaCl联合CaCl2调控GABA代谢前体Glu和PAs代谢的同时，CaCl2亦显著提高发芽大豆中AMADH的表达丰度。因此，NaCl胁迫下Ca2+通过上调这些关键蛋白的表达丰度来实现对GABA富集的调控作用。