影响水稻籽粒垩白形成与粒重的基因OsBT1的图位克隆与功能初步研究

Genetic improvement in rice quality is essential to secure the national food safety and meet the market needs in China. Rice chalkiness is a key trait of appearance quality, which negatively affects the processing and eating quality of rice. This proposal aims to clone and functionally characterize a novel gene deriving from a mutant eb5 with severe chalkiness and smaller grains. Our previous efforts have fine mapped the gene in a region of 39.5kb on Chr.2. Sequence analysis revealed that a 18bp duplication occurred in the 2nd exon of Open Reading Frame 2, which resulted in a 6 amino acid insertion in the protein. As the candidate gene of eb5, ORF2 encodes an adenosine diphosphate glucose (ADPG) transportor BT1 of Maize, thus we designated ORF2 as OsBT1. In this proposed study, the physicochemical properties such as starch, storage protein composition and content, starch chain length distribution and starch granule structure characteristics will be compared between eb5 and its wild type. We will conduct functional complementary test to confirm OsBT1 is eb5. The temporal- and spatial- expression patterns and protein subcellular localization of OsBT1 will also be analyzed. Furthermore, we will attempt to find out the starch synthesis related genes that differentially expressed in mutant and Wt. And yeast two-hybrid method will be employed to screen OsBT1 direct interactive proteins. The results of this project will help us to elucidate the mechanism of formation chalkiness and grain weight controlled by OsBT1, and provide a theoretical basis for the breeding of rice varieties with high-yield, low chalkiness.

为保障国家粮食安全，满足市场和消费者需求，稻米品质改良越来越受到重视。垩白对稻米的外观、加工、食味品质等都具有严重影响。本项目计划以一个表现为高度心白、千粒重显著降低的垩白突变体eb5为材料，比较eb5与野生型稻米的淀粉、蛋白质组分及含量、支链淀粉聚合度、淀粉颗粒结构等理化性质差异；同时对突变体基因开展图位克隆与功能研究。目前已将突变基因定位于Chr.2约39.5Kb的范围内，分析发现该区间内的ORF2第二外显子18个碱基出现了重复，导致了6个氨基酸的增加。ORF2编码蛋白类似于玉米腺苷二磷酸葡葡糖糖转运子BT1，因此，将ORF2作为候选基因，命名为OsBT1。下一步拟通过转基因验证其功能，同时分析OsBT1的时空表达、亚细胞定位特性，利用酵母双杂筛选其互作蛋白，分析OsBT1突变对淀粉合成相关基因的表达影响，初步阐明其调控水稻垩白形成与粒重的机理。为培育高产、低垩白水稻品种提供理论基础。

在谷类作物中淀粉含量占种子干重的60%-90%，对作物产量的形成具有重要意义。淀粉由直链淀粉和支链淀粉组成，其比例影响稻米的品质及其商品价值。迄今已报道很多淀粉合成酶基因和其他调控因子，但对淀粉合成的分子机制仍然不完全清楚，因此，鉴定、解析新的参与淀粉合成的基因具有重要的科学意义。在本研究中，我们从日本晴组培过程中产生的突变体中筛选到了一个垩白突变体osbt1并开展了深入研究，结果如下：.1. 突变体brittle1（osbt1）稻米呈现出心白的表型；胚乳细胞中间部分淀粉颗粒变圆，排列疏松；总淀粉含量和直链淀粉含量分别降低了2.17%和2.45%，支链淀粉中短链增加，中长链减少；突变体淀粉的粘度值降低到野生型的68%；糊化温度降低了3℃。这些结果说明OsBT1基因对胚乳细胞中淀粉的合成很重要。.2. 突变体osbt1的胚乳细胞中存在大量散乱分布的单个淀粉颗粒和体积较小的淀粉颗粒；造粉体的膜结构在胚乳发育前期就开始降解，不能形成正常的复合淀粉颗粒。该结果说明OsBT1基因对水稻胚乳细胞中复合淀粉颗粒的正常形成具有非常重要的作用。.3. 使用图位克隆方法鉴定到了目的基因OsBT1，功能互补实验证明了OsBT1就是造成突变体表型的基因。该基因编码含有425个氨基酸的跨膜蛋白，其N端有一个质体定位信号肽，在水稻中有3个拷贝。.4. OsBT1只在种子中特异表达，且在灌浆中后期表达水平最高，在根、茎、叶、叶鞘和幼穗中都不表达。GUS组织染色结果和定量结果一致。.5. 亚细胞定位将OsBT1编码的蛋白定位在胚乳细胞造粉体膜上。.6. 在osbt1突变体中，大部分淀粉合成相关基因的表达水平上调。淀粉合成酶SSI和质体磷酸化酶（Pho1和Pho2）的活性增加，而淀粉合成酶SSIIIa以及淀粉去分支酶ISA和PUL的活性和野生型相比没有显著差异。这说明OsBT1基因的突变不仅影响淀粉合成相关基因的表达，还影响了部分淀粉合成酶的活性。.本项目研究结果证明了OsBT1在水稻胚乳淀粉合成和复合颗粒形成中起着重要的作用。