柑橘青霉菌农药靶标酶CYP51活性部位结构与抑制机理研究

真菌病害是影响农业丰产的主要病害之一，特别是果蔬采后病害造成的损失巨大。柑橘青绿霉病是柑橘贮运期间发生的最严重病害，因其感染柑橘采后损失高达30%以上。研究柑橘青绿霉病原菌农药靶标酶活性部位结构及其抑制机理，对阐明农药抗性分子机理，促进高效低毒、安全的新型农药的研制有着非常重要的意义。本项目拟采用基因工程技术克隆柑橘青霉菌包括意大利青霉 (P.italicum)、扩展青霉(P.expansum)等的重要靶标酶CYP51基因，进行多样性分析；结合分子模拟、同源模建和定点突变技术研究柑橘青霉菌CYP51活性中心结构及其与抑制剂（DMIs）相互作用机理,从而阐明酶活性部位结构与功能的关系。通过分子对接设计新型的CYP51抑制剂，虚拟筛选并选择性合成高效抑制先导化合物，采用CYP51结合光谱法筛选新型抑制剂。为研发以CYP51为特异靶标的新型真菌杀菌剂奠定理论基础。

柑橘青绿霉病是柑橘贮运期间发生的最严重病害，研究柑橘青绿霉病原菌农药靶标酶抑制机理及其多样性分析，对阐明农药抗性分子机理，促进高效低毒、安全的新型农药的研制有着非常重要的意义。我们按计划圆满完成了“柑橘青霉菌农药靶标酶CYP51活性部位结构与抑制机理研究”。项目执行期间，我们从不同地区（包括湖北、江西、山东、海南等地）采集分离了柑橘青霉菌158株，采用18S rDNA结合ITS-rDNA序列双重鉴定法成功进行了分离鉴定，其中指状青霉89株、意大利青霉菌46株；其他菌株包括小刺青霉、扩展青霉、皮落青霉等共计23株。筛选出典型抗性株和敏感株，从50多株柑橘青霉菌（包括意大利青霉11株、指状青霉40多株）克隆了重要靶标酶CYP51基因（包括意大利青霉P.italicum和指状青霉P.digitatum的 Pi/PdCYP51A/B/C基因），并进行了多样性分析。完成了意大利青霉PiCYP51A和指状青霉PdCYP51B的同源模建与分子模拟；结合定点突变技术重点研究了意大利青霉菌和指状青霉菌CYP51活性中心结构及其与抑制剂(DMIs)相互作用机理。在同源模建基础上，通过分子对接、虚拟筛选并选择性合成了高效抑制先导化合物，采用CYP51结合光谱法体外筛选出新型DMI抑制剂6e系列农药先导化合物。为研发以CYP51为特异靶标的新型真菌杀菌剂奠定理论基础。.本项目取得的研究成果已在国际著名期刊J. Agric. Food Chem（SCI分级A区；农业科学和农药学领域前5%刊物）和Biotechnol Lett.发表SCI学术论文3篇，其它国内外重要学术期刊上发表论文10多篇。还有部分研究成果即将发表。该项目对培养研究生起到至关重要的作用，项目执行期间，先后有10名研究生参加，其中已毕业硕士生5名（研究生名单和学位论文题目附后）。