脂联素通过骨桥蛋白招募破骨细胞促进类风湿关节炎骨侵蚀分子机制研究

Adiponectin (AD) is the most abundant plasma adipokine. Working basis of our group and literatures showed that the high expression of AD in the inflammatory joint of rheumatoid arthritis (RA) patients, which participates in the pathologic process of RA bone erosion. However, the mechanism is still unclear. By gene chip analysis of the change in gene expression during osteoclast differentiation, we found that AD up-regulated osteopontin (OPN). OPN is an important anchored protein in the osteoclast deposition of RA. We propose the hyposis: AD can recruit the deposition of osteoclasts on the bone surface by promoting synovial osteopontin expression in the RA, and start the process of bone erosion. Therefore, in the present study we will construct CIA (collagen induced arthritis，CIA) mouse model and co-culture synovial fibroblasts and osteoclasts. Using the means of real time PCR, Western blot, adenovirus vector transfection and RNA interference to study the mechanisms of AD-mediated regulation on OPN and bone destruction, verify the above hyposis. These will provide theoretical and experimental evidences for the further research on intervention measures of the relief of bone destruction in RA.

脂联素(adiponectin，AD)是血浆中含量最多的脂肪因子，本课题组多年来的工作基础及文献均证实类风湿关节炎患者炎性关节中AD高表达并参与了RA骨侵蚀病理过程，迄今为止作用机制尚不明确。通过基因芯片分析破骨细胞分化过程中基因表达谱变化，申请人原创性发现AD能上调骨桥蛋白（Osteopontin，OPN）表达，而OPN在RA中起招募破骨细胞附着于骨面的角色。因此，我们提出假说：在RA中AD能通过促进关节滑膜组织表达OPN，招募破骨细胞沉积于骨面，启动骨侵蚀程序。本研究通过构建胶原诱导关节炎小鼠模型、滑膜成纤维细胞与破骨细胞共培养模型，采用Real-time PCR、Western-blot、腺病毒载体转染、RNA干扰以及小动物荧光活体成像等技术，系统研究AD对OPN的表达和介导招募破骨细胞的机理，验证上述假说，为治疗RA骨侵蚀寻找新的靶标提供理论与实验依据。

骨桥蛋白(OPN)可以诱导破骨细胞沉积于骨表面。基于此，我们推测中AD通过诱导滑膜组织中OPN表达，招募破骨细胞发挥骨侵蚀作用。.方法:采用酶联免疫吸附测定法对38例RA患者和20例健康对照者进行血清测定。采用免疫荧光法检测RA/OA滑膜组织中AD和OPN的表达。分别采用实时荧光定量PCR和免疫荧光法，检测AD激发后RA滑膜成纤维细胞中OPN的mRNA和蛋白表达。利用Transwell共培养法检测AD激发后的FLS对RAW264.7细胞诱导迁移作用。分别通过免疫组织化学、MicroCT断层扫描和TRAP染色分别检测了NC组、AD组以及OPN干扰组CIA小鼠关节组织中AD与OPN的共表达情况，以及破骨细胞表达情况，骨侵蚀发生状况。采用双重免疫荧光标记检测小鼠踝关节组织中的OPN和整合αvβ3的共表达情况。.结果: ELISA检测发现RA中AD以及OPN含量明显高于健康对照组，相关性分析提示在RA中AD与OPN表达具有相关性，而在OA中不具有上述相关性。体外实验同样证明，重组AD因子刺激 RA-FLS后，OPN mRNA以及蛋白水平明显升高，与ELILSA检测结果一致，同样在 OAFLS中未观察到相似结果，提示AD与OFN相关性可能存在疾病特异性。进一步研究，采用 Transwell共培养方式，采用AD刺激 RA-FLS后，RA-FLS与RAW264.7细胞共培养，结晶紫染色发现AD是通过刺激 RA-FLS分泌OPN诱导破骨细胞迁移。体内实验中，成功诱导CIA关节炎小鼠模型，将小鼠分为NC组，AD+CIA组，以及OPN基因沉默组，结果提示AD可以加重CIA小鼠滑膜炎及骨侵蚀，而沉默OPN基因后滑膜炎及骨侵蚀较AD组改善明显，免疫组化提示AD组CIA小鼠滑膜炎明显，滑膜组织中OPN表达明显增加，在OPN高表达滑膜周围可见大量破骨细胞富集，而OPN沉默组滑膜炎中OPN表达及破骨细胞表达则明显减少。通过免疫荧光法检测发现OPN基因可以与破骨细胞表面整合素αvβ3相结合，诱导破骨细胞迁移沉积，导致骨侵蚀发生。.结论:本项研究提供了AD诱导RA骨侵蚀的新证据。AD通过诱导RA滑膜组织表达OPN，进而OPN招募破骨细胞引发了骨侵蚀发生。这可能是AD促进RA骨侵蚀发生的机制之一。