TDZ诱导下马缨杜鹃离体叶片再生芽机制及其表达谱分析

Rhododendron is a world famous ornamental plant. Genetic engineering and cell engineering are the effective strategy to identify gene function and breed directionally, but the low and instability plant regeneration rate for most of the Rhododendron is the bottleneck to make sure the success of the methods. In this study , we intend to treat R. delavayi in vitro leaf with exogenous TDZ (0,0.05,0.1mg/L) to induce adventitious bud. By analysis the difference under different concentration and time from three aspects: tissue morphology during leaf cell growth and differentiation; how the in vitro leaf absorb and use the exogenous TDZ; the change process of the endogenous hormone effected by the exogenous TDZ, to discuss how the exogenous and endogenous hormone to control the formation of bud from in vitro leaf. At the same time, to confirm the key period of regeneration, take the leaves to analyse by RNA-Seq, then to screen the differentially expressed gene related with regeneration. The study aim to reveal the mechanism of how exogenous TDZ to induce adventitious bud from in vitro leaf of R. Delavayi. The results can afford theoretical basis and technical supprot for regeneration-difficult Rhododendron to regenerate, and is theoretically and practically meaningful for gene function research and directional breeding by biotechnology.

高山杜鹃是世界著名园林观赏植物。基因工程、细胞工程是近年来高山杜鹃基因功能研究和定向培育新品种的有效途径，然而大部分高山杜鹃植株难于再生和再生效率不稳定，成为其取得成功的瓶颈。为此，项目拟以0,0.05,0.1mg/L的外源TDZ诱导马缨杜鹃离体叶片再生芽，通过分析不同浓度下，不同时期离体叶片细胞生长和分化的组织形态，离体叶片对外源TDZ的吸收和利用，外源TDZ影响下的内源激素变化过程三方面的差异，探讨内外源激素对离体叶片再生芽的调控，同时锁定再生的关键时期，并对关键时期的叶片材料进行转录组测序，分析筛选与再生相关的差异表达基因，揭示外源TDZ对马缨杜鹃离体叶片再生芽的机制。研究结果可为顽拗再生型高山杜鹃植株再生提供理论依据和技术支持，有利于高山杜鹃基因功能研究和生物技术定向育种的顺利开展，具有重要的理论意义和实践意义。

杜鹃花离体叶片高效分化不定芽，对基于遗传转化的杜鹃花性状改良具有重要意义，然而叶片分化不定芽的机理却不是很清楚。基于0.1mg/LTDZ高效调控马缨杜鹃离体叶片分化芽的结果，项目从形态和组织细胞学、内源激素代谢，转录组学3个层次揭示外源TDZ高效调控马缨杜鹃离体叶片分化芽的作用机制。结果表明，马缨杜鹃离体叶片分化不定芽起源于表皮几层细胞和维管束周围薄壁细胞，经历细胞增殖（s1：0-15d）、细胞脱分化（s2：15-22d）、细胞再分化（s3：22-35d）、不定芽原基形成与发育（s4：＞35d）4个重要发育阶段。0.1 mg/L TDZ加入，启动叶片维管束附近薄壁细胞和表皮下几层细胞活跃增殖，且两者都突出表皮，形成与母体相连或物理隔离的突起或球状组织，最终发育形成不定芽。细胞分裂素的4种核糖核苷形式（iPR、tZR、cZR、DHZR）、IAA和ABA参与调控马缨杜鹃离体叶片分化不定芽。外源TDZ调控下，s2是内源激素变化的关键时期，iPR和cZR是调控叶片分化芽的关键内源激素因子，高含量IAA协同其正向调控，而低含量的内源ABA方向协助叶片获得再生能力，促进不定芽形成。4个发育阶段对照和0.1mg/LTDZ处理的转录本两两比对得到1723个差异基因。主要注释到植物激素信号转导，DNA复制、氨基糖和核苷酸糖合成、苯丙素生物合成路径。外源TDZ的激发下，AHK4基因、3个细胞分裂素响应因子基因（ARR6，ARR9，ARR17）、生长素早期应答关键基因（AUX22B，IAA13，IAA27）和生长素流转运蛋白基因（LAX2，LAX3）上调表达，伴随调控DNA复制、细胞壁形成和修复的一系列基因差异表达，促进细胞增殖和分化，最终高效完成离体叶片分化芽；细胞分裂素响应因子基因（ARR6，ARR9，ARR17）可能在不定芽形成中具有重要的调控作用。以上结果将促进杜鹃花植株再生机理的分子调控研究，指导支撑高效稳定的遗传转化体系的建立。