缺血性卒中再灌注后TRPC6介导脑血管内皮细胞损伤的机制研究

Reperfusion injury after ischemic stroke may increase the risk of hemorrhagic transformation with thrombolytic therapy. However the specific molecular mechanism is still unknown. Studies have shown that reperfusion injury or hemorrhagic transformation were associated with blood-brain barrier damage. BBB damage is mainly because the increased permeability of endothelial cells which due to the tight junction protein changes. TRPC6 is a non-selective cation channels can regulate the flow of calcium ions. Elevated intracellular calcium can cause blood-brain barrier damage. Reactive oxygen species generated by ischemia and reperfusion can cause cerebral vascular endothelial cell permeability increases, but whether TRPC6 could be an intermediate signaling molecules constitute one of the signaling pathway is unknown. We will use HBMEC cells combined with a variety of experimental methods to reveal the mechanism of ischemic stroke induces endothelial cells reperfusion injury by stimulating TRPC6 via elevation of reactive oxygen species. Also the study would provide prevention targets for cerebral hemorrhage due to ischemic stroke reperfusion injury caused by blood brain barrier damage.

缺血性卒中溶栓治疗后再灌注损伤可增加出血性转化的风险，具体分子机制不明。研究显示再灌注损伤、出血性转化均与血脑屏障的损伤及紧密连接破坏引起的内皮细胞渗透性增高有关。TRPC6通道是一种非选择性阳离子通道，可调节钙离子的内流，细胞内钙升高可引起血脑屏障损伤；缺血再灌注产生的氧自由基也可引起脑血管内皮细胞渗透性增加，但TRPC6钙离子通道是否作为中间信号分子将二者联系在一起构成血脑屏障损伤信号通路之一不得而知。前期实验证明在肾脏足突状细胞中高糖可通过ROS激活TRPC6通道导致钙超载。本课题拟应用脑微血管内皮细胞（HBMEC）作为模型，利用缺氧/再氧化处理模拟缺血再灌注引起的氧供变化结合各种实验方法，揭示TRPC6通道是由低氧/再氧化产生的氧自由基激活而增加细胞内钙离子浓度并对内皮细胞紧密连接造成损伤的新机制，为临床缺血性卒中再灌注后由于血脑屏障损伤导致的脑出血的预防提供靶点。

缺血性卒中溶栓治疗后再灌注损伤可增加出血性转化的风险，具体分子机制不明。研究显示再灌注损伤、出血性转化均与血脑屏障的损伤及紧密连接破坏引起的内皮细胞渗透性增高有关。TRPC6通道是一种非选择性阳离子通道，可调节钙离子的内流，细胞内钙升高可引起血脑中屏障损伤；缺血再灌注产生的氧自由基也可引起脑血管内皮细胞渗透性增加，但TRPC6钙离子通道是否作为中间信号分子将二者联系在一起构成血脑屏障损伤信号通路之一不得而知。我们前期实验证明在肾脏足突状细胞中高糖可通过ROS激活TRPC6通道导致钙超载。本课题应用脑微血管内皮细胞（HBMEC）作为模型，利用缺氧/再氧化处理模拟缺血再灌注引起的氧供变化并结合各种实验方法，结果显示TRPC6参与了HBMEC细胞缺氧/再氧化（H/R）后渗透性的改变，H/R后HBMEC细胞的TRPC6通道加速向细胞膜转运并激活；缺氧/再氧化还可通过激活NADPH氧化酶中NOX2（包括跨膜亚基代表gp91以及功能亚基p47），合成过量的超氧化物O2-增加氧自由基产生，超氧化物O2-同样可以破坏脑血管内皮细胞层，增加渗透性；我们应用DMNQ超氧化物提供前体模拟O2-可以激活TRPC6通道，从而使细胞内钙离子浓度升高，升高的细胞内钙可调节内皮细胞紧密连接蛋白（ZO-1，Occludin），使其降解或从细胞间连接处转移，破坏紧密连接结构，最终导致内皮细胞层跨膜电阻降低及渗透性增加，而应用抗氧化剂（Apocynin以及TEMPOL）或抑制TRPC6活性可以抵御H/R造成的渗透性改变。本研究揭示TRPC6通道是由低氧/再氧化产生的氧自由基激活而增加细胞内钙离子浓度并对内皮细胞紧密连接造成损伤的新机制，为临床缺血性卒中再灌注后由于血脑屏障损伤导致的要脑出血的预防提供靶点。