用于基因突变和SNP分析的高分辨熔解曲线分析仪研制

High resolution melting curves analysis (HRM) is a new powerful tool for gene mutation and SNP detection. In order to solve the deficient of HRM analyzer in scientific research, we find the new mathematical empirical model, that using free-form algorithm to analyze the DNA melting process, and develop high throughput specialized HRM analyzer instrument. First by analyzing the detects of nearest neighbor thermodynamic model of double stand DNA melting, we employ the free-form algorithm to extract the feature of melting curves and find the complex physics laws of the process. Then new thermal system based on pressure controlled heat pipe and optical system based on high speed light switching array are developed to fulfill the requirements of high resolution temperature control and fluorescence detection. The thermal block and optical block are combined with micro-lens and optical fiber coupling engineer crafts. The key parameters of temperature and fluorescence for high resolution melting analysis are: the temperature control accuracy of 0.02℃, the temperature uniformity of ±0.05℃, and multi-channel fluorescence data density of 100-200 data/℃. Finally, a high-performance HRM analyzer with the first set of independent intellectual property rights is developed. The sensitivity of gene mutation and SNP detection will be 0.1% and the instrument will be verified in bio-medical applications. This project will provide new technical means for the relevant scientific research and original innovation.

高分辨熔解曲线分析（HRM）是基因突变检测和SNP分析的新方法，为解决科学研究缺乏HRM分析仪的瓶颈，项目通过分析最近邻热力学模型缺陷，提出运用free-form特征提取发现复杂DNA熔解过程中物理规律的新思想，并研制高通量的专用HRM分析仪。针对HRM分析仪对温度控制和荧光检测的高分辨率要求，设计压控热管恒温槽构建高分辨热学系统控制新方法，基于光开关阵列高速切换的多路荧光检测技术实现高分辨快速荧光采集。通过微透镜、光纤耦合等制造工艺，使光学检测元件在结构上与热学模块无缝集成，同时保证温度控制和荧光检测的高分辨率，以保证仪器控温精度0.02℃、均匀性±0.05℃和多路荧光快速采集（100-200个数据/℃）的核心指标，研制出突变检测灵敏度达0.1%的首套自主知识产权的高性能HRM分析仪，并完成生物医学验证，为相关科学研究和原始创新提供新的技术手段。

高分辨熔解曲线分析（HRM）是基因突变检测和SNP分析的新方法，为解决科学研究缺乏HRM分析仪的瓶颈，项目通过分析最近邻热力学模型缺陷，提出运用free-form特征提取发现复杂DNA熔解过程中物理规律的新思想，并研制高通量的专用HRM分析仪。本项目经过四年的执行，已成功实现项目目标仪器高分辨熔解曲线分析仪的研制,圆满完成项目规定的各项任务。.在关键技术研究和核心模块开发方面；（1）温度控制，研发了基于“压控热管恒温腔”的高分辨温度控制系统。目前在实验模块上已达到控温精度0.02℃，孔间均匀性±0.05℃，在工程化样机上可实现控温精度0.05℃，孔间均匀性±0.1℃。（2）荧光检测，已研究设计并实现两种方案实现高速高通量微弱荧光信号采集：PMT+扫描阵列方案和CCD成像式。目前基于扫描阵列和基于CCD的光学检测分析系统均可在40分钟内完成96通量HRM分析，已可达到0.1%的突变检测灵敏度。（3）在算法设计和软件开发方面，采用基于free-form的熔解曲线特征提取方法，研究改进遗传编程算法对DNA熔解曲线模型进行优化，提高其表示精度，揭示熔解曲线微特征通过大量的待定函数的遗传进化进行符号回归，已得到一个可以精确表示不同位点SNP突变熔解曲线的数学模型。.在仪器工程化开发方面，自主开发设计了在工程化过程的各种工装器件，已完成高分辨熔解曲线分析仪工程化开发工作，并已形成工程化样机，经过第三方检测，相关技术指标达到国际先进水平，满足任务书要求。.在生物医学验证方面，正在进行针对拷贝数变异、甲基化检测等科学问题的验证研究。如在EGFR（CNV）拷贝数变异和大肠癌Septin9甲基化检测中基于本项目研制仪器的高分辨熔解曲线（HRM）分许技术既能检测EGFR突变，同时又能通过PCR方法检测其拷贝数变异。同时基于HRM可以无创的检测大肠癌的重要分子标志Septin9基因的甲基化，有望成为大肠癌等肿瘤的无创早期筛查的重要技术。.项目组通过积极参与相关领域主流国际会议、邀请国外专家访问等方式，与国外同行进行了深入的学术交流与合作，其中和本领域国际顶尖团队美国犹他大学病理系Wittwer DNA实验室建立了长期合作关系。