家蚕PLP的合成调节和合成后向缺辅基酶的转移机制

Pyridoxal 5′-phosphate (PLP) is the catalytically active form of vitamin B6 (VB6), and plays extensive and important roles in all organisms. In animals, PLP is synthesized via a "salvage pathway", which essentially involves two ubiquitous enzymes: an ATP-dependent pyridoxal (PL) kinase and an FMN-dependent pyridoxine 5′-phosphate (PNP) oxidase. Once it is made, PLP is targeted to the dozens of different apo-VB6 enzymes that are being synthesized in the cell. The regulation of the salvage pathway and the mechanism of addition of PLP to the apo-VB6-enzymes are poorly understood and represent a very challenging research field. We found that the regulation of the salvage pathway, which depends on hormone levels, is very clear in Bombyx mori, and the PLP levels determine the larva development and the spun silk protein production. Therefore, the study of the regulation of the salvage pathway and the mechanism of addition of PLP to the apo-VB6-enzymes bears the important theoretic and practical significance. We have cloned and characterized the cDNA coding PL kinase and PNP oxidase from Bombyx mori, and the structure and functions of the proteins also have been analyzed. Based on which, the regulating effects of juvenilehormone and ecdysteroids on the salvage pathway and the regulatory mechanisms at the molecular level will be investigated. The transgenic and RNAi methods, together with transcriptome and proteome analyses, will be used to reveal the regulating steps in PLP synthesis, their related biochemical processes and VB6 metabolic engineering. The mechanism of PLP transfer to the apo-VB6-enzymes will also be examined by analyzing the enzymatic subcellular localization and protein-protein interaction network. The purpose of this study is to resolve a key issue in the molecular nutrition of Bombyx mori and to disclose the physiological and biochemical characteristic of insects. Our project will contribute to the basic study on life science and human health.

PLP是140多种细胞酶的辅酶。动物通过PL激酶和PNP氧化酶合成PLP。PLP的合成调节和合成后向缺辅基酶的转移机制，是细胞生命活动极为重要的基础环节，是普遍生物学问题。我们发现家蚕PLP的合成调节尤为显著，明显存在激素的作用，PLP水平是幼虫蜕皮后生长和绢丝蛋白合成的决定因素，开展其分子机理和VB6代谢工程研究具有重要意义。为此，我们克隆出家蚕PL激酶和PNP氧化酶cDNA、明确了基因及其编码蛋白的结构和功能特点。本项目进一步剖析激素对PLP合成的调节作用和酶作用分子水平上的调节机制；采用转基因和RNAi方法结合转录组和蛋白组学分析，揭示PLP合成的限速步骤和关联生化过程，探索VB6代谢工程；通过酶的亚细胞定位和蛋白质相互作用的网络分析，探讨PLP合成后的转移机制。旨在解决家蚕的一个重要营养问题的分子机理，揭示昆虫类生物的特殊生理生化机制，为生命科学和人类健康的基础研究做出一定贡献。

维生素B6是一类吡啶衍生物的总称，包括吡哆醇（PN）、吡哆胺（PM）、吡哆醛（PL），磷酸吡哆醇（PNP）、磷酸吡哆胺（PMP）和磷酸吡哆醛（PLP）。其中，PLP是140多种细胞酶的辅酶，涉及广泛的代谢和调节过程。人和动物从食物中获得维生素B6，通过PL激酶和PNP氧化酶合成PLP。PLP的合成调节和合成后的转移机制，是细胞生命活动极为重要的基础环节，是普遍生物学问题。我们发现家蚕PLP 的合成调节尤为显著，明显存在激素的作用，PLP 水平是幼虫蜕皮后生长和绢丝蛋白合成的重要决定因素之一。为此，我们克隆出家蚕PL 激酶和PNP 氧化酶cDNA、明确了基因及其编码蛋白的结构和功能特点。本项目进一步剖析了主要昆虫激素对PL激酶和PNP氧化酶基因表达的调节作用；采用RNA干扰技术揭示了转录水平上PL激酶和PNP氧化酶的合成调节；采用酵母双杂交系统捕捉与PL激酶和PNP氧化酶发生相互作用的蛋白，探讨了PLP合成后的转移机制。结果表示：家蚕PL激酶和PNP氧化酶的基因表达受到发育性调节，蜕皮激素具有明显的促进作用，而保幼激素表现出相反的作用效果；家蚕体内PL激酶和PNP氧化酶的基因下调，均导磷酸丝氨酸氨基转移酶和谷草转氨酶基因转录水平的显著下降，提示PLP合成酶和PLP依赖酶存在联动调节机制、涉及基因调控网络；利用酵母双杂交系统鉴定出若干与PL激酶和PNP氧化酶存在相互作用的蛋白，但这些蛋白都不是PLP依赖酶，结果不支持PLP合成后的“通道传递”假设。我们还首次解析了人体PL激酶和PNP氧化酶近端启动子的结构和功能，明确了发挥主要调节作用的转录因子，为PLP合成酶表达调控机制的研究奠定了基础；鉴定和表征了家蚕PLP磷酸酶，有助于PLP水平动态平衡机制的研究。本项目研究解决家蚕的一个重要营养问题的分子机理，揭示昆虫类生物的特殊生理生化机制，促进生命科学和人类健康基础研究的进步。