水稻特异抽穗期关键基因Ehd1的分子作用机理研究

Heading date of rice is an important agonomic trait. Ehd1 is the key heading date gene, encodes a transcription regulator that have no ortholog in the Arabidopsis genome. Ehd1 is an integrator gene that regulated by different flowering signals. The upstream genes can regulate mRNA levels of Ehd1: promoting its expression will shorten the heading date, inhibiting its expression will prolong the heading date. In previous works we have proved that Ehd1 can regulate the expression of rice florigen genes Hd3a and RFT1. However, whether Ehd1 can directly binding the promoters of Hd3a and RFT1, and what is the conservative DNA elements for its binding, are still unknown. We developed the overexpression Ehd1-FLAG materials and Ehd1 tansgene silencing materials. In this study we will use these materials to identifiy the conservative DNA elements for Ehd1 binding and the direct target genes of Ehd1,through RNA-seq, ChIP-seq, and in vitro screening DNA sequences for protein binding. In addition, we will analysis the promoter diversity of these target genes that contain the conservative DNA element among sequencing rice cultivars and wild rice speciese. We will also screen for interactors of Ehd1 by pull-down/MS and yeast two-hybridization. The findings in this study will be significant for elucidation of the molecular mechanism of Ehd1, and provide valuable implications on gene promoter editing for heading date control and yeild improvement of rice.

抽穗期是水稻的重要农艺性状。Ehd1是水稻特异的抽穗期关键基因，编码一个转录因子。Ehd1是多种抽穗信号的整合者，不同上游基因对它的调控主要体现在表达水平：增加其表达促进抽穗，降低其表达抑制抽穗。申请人前期工作证明Ehd1能促进下游开花素基因Hd3a、RFT1的表达。但Ehd1是否能直接结合Hd3a、RFT1的启动子，结合的具体DNA保守元件是什么？尚未见相关研究报道。本研究利用已经培育的过量表达Ehd1-FLAG材料和Ehd1转基因共抑制沉默材料，通过转录组、染色质免疫共沉淀测序分析，和体外筛选DNA结合元件等技术，鉴定出Ehd1直接结合的保守DNA元件和调控的基因；开展受调控基因启动子区DNA元件的多样性调查；利用蛋白下拉联和质谱分析以及酵母双杂交技术，确定Ehd1的互作蛋白并开展功能研究。本项目将深入揭示Ehd1的分子作用机理，为基因编辑启动子序列调控水稻抽穗期提供有价值的新发现。

水稻是短日植物，抽穗期是水稻品种的重要农艺性状。Ehd1编码转录因子，其表达受到众多上游基因的调控，是水稻特有的关键抽穗期基因。Ehd1能促进下游成花素基因Hd3a、RFT1的表达，但具体作用机制未知。Ehd1表达增加促进抽穗但负调控产量相关的农艺性状，表达降低延迟抽穗能提升农艺性状，具有潜在的应用价值。本项目针对Ehd1的分子作用机制和其育种应用价值开展了如下研究并取得了相应的结果：.（1）利用蛋白下拉联合质谱分析以及酵母双杂交技术，筛选与Ehd1互作的候选蛋白，最终证明光敏素受体OsPHYB与Ehd1互作。通过创建ehd1、phyb的单突变体和双突变体材料，发现OsPHYB位于Ehd1的上游，通过抑制Ehd1延迟抽穗。后续将深入探究OsPHYB通过调控Ehd1而控制抽穗的分子机制和生物学意义。.（2）利用不同的Ehd1遗传材料，通过转录组、DNA亲和纯化测序、染色质免疫沉淀测序分析、酵母单杂交技术、荧光素酶互补实验和基因编辑技术，发现并验证了Ehd1能够直接结合RFT1启动子上的特定DNA元件，促进其表达。从而深入揭示了Ehd1促进成花素表达的分子作用机理。（这部分工作主体已经完成，正在撰写专利和论文，2023年下半年投稿。）.（3）通过分析Ehd1启动子区的顺式调控元件，构建了基于CRISPR/Cas9的启动子多靶点编辑载体，转化粳稻品种中嘉8号。在T1和T2代中选择抽穗期介于野生型和ehd1突变体之间的稳定株系，调查抽穗期和农艺性状，检测Ehd1、Hd3a和RFT1的表达，并利用第三代测序技术获得靶点变异。最终筛选到启动子区纯合等位突变且无T-DNA插入，抽穗期稍延迟和农艺性状提升的Ehd1功能弱化的材料供后续育种选择，为解决粳稻在华南地区极早抽穗农艺性状差的提供了新方法。因此，本研究为优良底盘品种抽穗期的微改良和推广提供了一种快速创造和筛选启动子多种变异，获得目标表型的育种新策略（这部分研究工作已经完成，专利和论文撰写基本完成，2023年初投稿。）.在项目的支持下，已经发表相关论文4篇，New Phytologist (项目第3标注)，Journal of Genetics and Genomics (项目第一标注), 华南农业大学学报(项目第一标注), Science China Life Sciences(第一作者)。