Pitx1介导IHH调控后肢软骨发育的分子机制

Congenital clubfoot (CCF) is a common congenital foot malformations which threated children health seriously, and the etiology is not clear. Our recent researches have revealed that the etiology of CCF might have relationship with achondroplasia of hindlimb in early development of embryo, and Ihh play a key role in embryo entochondrostosis. We also found that retinoic acid had a dose-dependent effect on delaying hindlimb bud cartilage development and inhibiting the expression of Pitx1 and IHH which also have taken on a definitely correlation. In order to clarify the pathogenesis of hindlimb cartilage development , our study intends to use the CCF's rat models which have been exposed by retinoic aicd to analyze the causal relationship between Pitx1 and Ihh signal in early development of embryo. To illustrate the cause of CCF's rat models phenotype is helpful to explore human CCF's heredity factors, since CCF's rat models corresponded to human neonate.

先天性马蹄内翻足（CCF）是严重危害儿童健康的常见足部畸形，病因未明。我们前期研究发现CCF病因可能源于胚胎早期后肢软骨发育不全,而Ihh在胚胎早期软骨内成骨中发挥着重要的调控作用。近期实验又发现维甲酸呈剂量依赖性抑制后肢芽软骨的发育，同时抑制Pitx1与Ihh信号家族基因表达，且后两者表达呈现一定的趋势相关性，因此，拟通过构建大鼠胚胎CCF模型，对维甲酸作用后的早期胚胎后肢芽组织进行系统分析是否存在Pitx1 与IHH信号通路之间的联系，进而影响后肢软骨发育的分子机制.鉴于CCF模型与人类新生儿有较好的一致性，如能借此阐明CCF动物模型表现型的成因，则对人类CCF遗传因素的探讨大有裨益。

尽管反式维甲酸（all-trans-retinoid acid ，ATRA）导致先天性肢体畸形的体内和内外模型已经研究得十分广泛，然而它的作用机制至今仍然不明确。最新研究表明Pitx1基因只特异表达在后肢芽基质细胞，并且该信号通路可能是导致先天性马蹄足高发的病因。因此，本研究将从Pitx1对后肢芽基质细胞成软骨分化的调控方面来阐明先天性马蹄足的发病机理。通过不同浓度的全反式维甲酸对孕12.5天的大鼠后肢芽细胞进行处理，采用Cell Counting Kit-8 (CCK-8)对大鼠原代后肢芽细胞增殖情况进行检测，将对大鼠原代后肢芽基质细胞存活无影响而对其增殖能力起最大抑制作用的维甲酸定义为最适宜的浓度用于后续研究。采用蕃红O-快绿染色及阿利新蓝染色观察软骨结节的形成情况，细胞免疫荧光检测Pitx1蛋白的分布情况，通过实时定量RT-PCR及蛋白免疫印迹技术分别对不同维甲酸浓度处理下大鼠原代后肢芽基质细胞Pitx1及软骨特异性分子Sox9 、Col2al在基因及蛋白水平表达变化情况进行测定，结合不同浓度下的结果进行综合分析Pitx1、Sox9及Col2al的变化情况。全反式维甲酸处理抑制了大鼠原代后肢芽基质细胞的增殖，并且发现作用于大鼠原代后肢芽基质细胞的全反式维甲酸的最佳浓度为1nM。同时，经过全反式维甲酸处理后软骨结节的数量及大小与维甲酸的浓度成剂量依赖性降低。细胞免疫荧光结果提示Pitx1主要表达在软骨结节。经过全反式维甲酸处理后，Pitx1、Sox9及Col2al mRNA 及蛋白均呈下降趋势，并且下降的程度与全反式维甲酸浓度的高低呈一致性。全反式维甲酸通过下调Pitx1的表达从而抑制软骨特异性分子的表达，如Sox9 及 Col2al，进而对大鼠原代后肢芽基质细胞成软骨分化起到抑制作用。