脂质诱导的CD1d-依赖和非依赖信号改变对肝脏NKT细胞的影响

肝脏自然杀伤T细胞（NKT细胞）缺陷在非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）进展及其相关的慢性炎症状态、胰岛素抵抗中起重要作用。异常脂质诱导的肝内免疫、炎症信号改变可能是NAFLD小鼠肝内NKT细胞下降的初始因素，因此本研究拟从体内外证实：1）建立高脂饮食诱导的小鼠脂肪肝模型，分离肝细胞和Kupffer细胞，以流式细胞术从单细胞水平分析肝内CD1d表达变化和细胞定位。2）分离纯化肝细胞和Kupffer细胞，建立体外与NKT细胞的混合培养系统，观察脂质干预对肝细胞和Kupffer细胞CD1d分子介导的内/外源性脂质抗原递呈功能的影响、对NKT细胞功能分化、活化和增殖的影响。3）利用CD1d基因敲除和CD1d抗体证实非CD1d依赖的炎性信号改变在脂质诱导的肝脏Kupffer细胞表型和功能变化对肝脏NKT细胞影响中的作用。从而系统阐明脂质诱导的CD1d依赖和非依赖信号变化在肝脏NKT细胞缺失中的作用。

摘要：背景 NKT细胞是机体天然免疫的重要组成部分，NKT细胞数量和功能的缺陷在非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的发展及其相关的Th1/Th2失衡的慢性炎症状态、胰岛素抵抗中起重要作用。方法：为进一步明确在NAFLD发展过程中肝脏NKT细胞缺乏的CD1d依赖和非CD1d依赖机制，本研究通过建立体内外高脂环境模型，分离肝脏实质和非实质细胞，并建立体外细胞混合培养体系，观察体内外高脂干预对肝细胞和Kupffer细胞CD1d分子依赖和非依赖的内/外源性脂质抗原递呈功能的影响及对NKT细胞活化和增殖的影响。结果：（1）饮食中饱和脂肪酸（SFA）和单不饱和脂肪酸（MUFA）可引起肝脏NKT细胞显著减少（p<0.05），且保留的NKT细胞分泌更多的促炎细胞因子，而多不饱和脂肪酸则无明显影响。高脂饮食引起肝内kupffer细胞明显增加（p <0.01）。（2）高脂饮食和体外脂肪酸处理引起肝细胞CD1d表达下降，但对kupffer细胞的CD1d表达无明显影响。（3）体内外高脂处理明显减弱CD1d介导的肝细胞对NKT细胞的内源性脂质抗原的递呈功能（p<0.05），对外源性脂质抗原的递呈功能无显著影响。（4）Kupffer细胞几乎不递呈内源性脂质抗原，但体外脂肪酸处理减弱了CD1d介导的Kupffer细胞对NKT杂交瘤细胞的外源性抗原的递呈功能（p<0.05）。（5）体外脂肪酸处理可明显降低kupffer细胞对原代NKT细胞的活化作用（以分泌IFN-减少为主,p<0.05）。（6）体外脂肪酸处理可显著增加kupffer细胞和原代NKT细胞共培养系中细胞因子IFN-和IL-4 mRNA的表达。（7）体内外高脂处理显著增加kupffer细胞炎性细胞因子及TLR4 mRNA的表达。结论：饮食中不同的脂肪酸成分对肝脏NKT细胞具有不同的影响。高脂显著影响肝细胞CD1d介导的内源性脂质抗原的递呈功能，从而影响肝脏NKT细胞的活化。高脂引起kupffer细胞M1的极化通过CD1d-非依赖的促炎途径的活化而促进NKT细胞早期过度活化而凋亡。因此，肝脏实质细胞和非实质细胞可能通过不同的途径促进NAFLD发展时肝内NKT细胞的缺失。