水稻开花抑制基因OsCOL15的功能和分子机理研究

The precise control of flowering time (heading date) is critical for reproductive success of rice breeding, and determines the regional and seasonal adaptability and yield potential of rice varieties. In Arabidopsis, AtCOL15 interacts with several AtHAP3 and AtHAP5 homologs, and the AtCOL15-AtHAP3-AtHAP5 complex may regulate flowering. Overexpression of OsCOL15 resulted in a delayed flowering phenotype under both SD and LD conditions. RT-qPCR assay suggested that OsCOL15 suppresses flowering by up-regulating the flowering repressor Ghd7 and down-regulating the flowering activator RID1, thus leading to the down-regulation of the flowering activators Ehd1, Hd3a, and RFT1. OsCOL15 may form a complex with proteins which encoded by rice orthologs of AtHAP3 and AtHAP5 to regulate flowering. In this project, we will clarify the location of OsCOL15 by using qRT-PCR combined with genetic experiments; screening the interacting protein of OsCOL15 by yeast two-hybrid assay and the binding promoter sequences of downstream genes of OsCOL15 by bacterial one-hybrid; also carrying out domestication analysis of OsCOL15, ultimately exploring the molecular mechanisms of OsCOL15 which controlling flowering in rice.

精确控制开花时间（抽穗期）是水稻繁殖成功的关键，并决定水稻品种的地区和季节适应性及产量潜力。拟南芥AtCOL15和AtHAP3及AtHAP5互作形成AtCOL15-AtHAP3-AtHAP5复合物参与开花调控。在之前的研究中，申请人发现过表达AtCOL15的水稻同源基因OsCOL15在短日照和长日照条件下均抑制开花。RT-qPCR实验表明OsCOL15通过上调Ghd7和下调RID1的表达，导致下调Ehd1、Hd3a和RFT1的表达来抑制开花。由此，我们发现OsCOL15可能与AtHAP3和AtHAP5的水稻同源基因形成复合物调控水稻开花。本项目拟利用RT-qPCR结合遗传实验探明OsCOL15的上游调控基因，通过酵母双杂交筛选OsCOL15的互作蛋白，利用细菌单杂交寻找OsCOL15结合的下游基因启动子序列，并对OsCOL15进行驯化分析，最终探明OsCOL15抑制水稻开花的分子机制。

抽穗期决定水稻品种的地区和季节适应性，是水稻最重要的农艺性状之一，深入研究水稻成花转变的分子机理有重要的理论和现实意义。在前期研究中，我们发现过表达OsCOL15在杭州自然长日照和海南自然短日照条件下均延迟抽穗。为了进一步解析OsCOL15调控水稻抽穗的分子机制，通过酵母双杂筛库，我们发现OsHAP3D与LOC_Os03g15890和OsCOL15互作，并通过Pull-down、Co-IP和BiFC实验进行证明。OsHAP3D编码一个核因子Y的B亚基家族（NF-YB）基因，前人研究表明HAP家族复合体可以结合到启动子的CCAAT基序上调控靶基因表达，我们发现过表达OsHAP3D在长日照条件下抑制开花。LOC_Os03g15890编码一个含RNA识别基序的表达蛋白，我们研究发现其可能不参与水稻光周期开花调控。之前的研究表明，拟南芥CO蛋白的CCT结构域和HAP2蛋白结构相似。因此，CO可替代AtHAP2形成CO-AtHAP3-AtHAP5三聚体。后续又发现水稻中调控开花的CCT家族蛋白与HAP家族蛋白之间存在互作关系，且CCT家族蛋白也与HAP2蛋白结构相似，也可以代替HAP2与HAP3和HAP5组成CCT-HAP3-HAP5三聚复合体。由此，我们将OsHAP3D作为核心进行后续研究，结果显示OsHAP3D与OsHAP5A/B/C/D均互作，后续也通过Pull-down和Co-IP实验进行了证明。此外，在Pull-down实验中，我们发现OsCOL15与OsHAP5A/B/C/D不互作，但是Co-IP实验结果显示OsCOL15与OsHAP3D和OsHAP5A/B/C/D三者之间两两互作。由此推测，OsCOL15与OsHAP5A/B/C/D的互作发生在体内，而在体外不互作，这也为后续三复合体的功能研究奠定分子基础。此外，我们还分离鉴定了OsBBX19基因，并对其控制水稻抽穗的分子机理进行了初步研究。过表达OsBBX19在自然长日照条件下抑制开花，同时增加株高和产量。OsBBX19编码一个核转录因子并具有节律表达模式。Pull-down、Co-IP和BiFC实验表明OsBBX19与OsHAP3D和OsCOL15之间也存在互作。通过对OsCOL15与OsBBX19的研究，为深入了解CONSTANS-like基因调控水稻抽穗期的作用机理奠定了坚实的基础。