PITX3及其突变在先天性白内障合并眼前节发育不良中的功能和分子机制研究

Congenital cataracts may occur as isolated defects or be associated with other ocular anomalies, causing visual loss or disturbance. Our previous analyses identified a novel mutation of the PITX3 gene in a Chinese family of congenital cataract with anterior segment dysgenesis, which was the first identification of PITX3 mutation in our country. PITX3 is a transcription factor and international studies have reported 6 mutations of it. However, the functions of this gene are still far from elucidation. Therefore, we plan to investigate the effect of this mutation on the expression level, product length, DNA binding ability and transcriptional activity of PITX3, and explore the role of this gene and its mutation in cell proliferation, cell cycle distribution, apoptosis and differentiation of ophthalmic cell lines. In addition, we will screen interactors of this protein through immunoprecipitation followed by mass spectrometry and validate the protein-protein interactions; identify transcriptional targets of this transcription factor by RNA-seq analyses of embryonic tissues of both wild type and aphakia(ak) mouse with the PITX3 gene spontaneously defected, and ChIP-seq analyses in cell lines, and validate the transcriptional regulation; find the upstream transcription factors of this gene; and further conform the expression level of these related genes and proteins in the mouse models. From all these perspectives, we seek to perform an in-depth investigation on the pathogenic mechanisms of PITX3 mutations. Taken together, this study may increase the knowledge of functions and mechanisms of the PITX3 gene, and provide new clues for molecular mechanistic study and clinical treatment of congenital cataract and anterior segment dysgenesis.

先天性白内障可单独发病或与其它异常关联，损伤视力。本课题组前期在一个中国的先天性白内障合并眼前节发育不良家系中鉴定出转录因子PITX3的一个新突变。此前国际上报道了该基因6个突变，国内则无报道，其功能和机制研究十分有限。本课题拟检测该突变对蛋白的表达水平、产物大小、亚细胞定位、DNA结合和转录活性的影响；在眼科细胞系中检测PITX3对细胞增殖、周期、凋亡和分化的作用，以及该突变对这些细胞功能的影响。我们将进一步通过免疫沉淀和质谱筛选PITX3的相互作用蛋白并验证；通过对野生型和自发突变小鼠的胚胎组织进行RNA-seq分析，结合细胞中的ChIP-seq分析，筛选其下游靶基因并验证；寻找其上游转录因子；在小鼠模型中进一步验证以上相关基因或蛋白，从这些角度深入研究PITX3突变的致病机制。本研究将进一步阐明PITX3的功能和机制，为先天性白内障和眼前节发育不良的分子机理和临床治疗提供新的线索。

先天性白内障可单独发病或与其它异常关联，损伤视力。寻找一个常染色体显性先天性白内障家系的致病基因；调查中国常染色体显性先天性白内障家系中由PITX3突变导致的先天性白内障患病情况，并探究PITX3突变导致白内障的致病机理。本研究对象为一个患有常染色体显性先天性白内障（ADCC）家系，这是一个为四代遗传的后囊下白内障家系；遗传模式符合单基因疾病常染色体显性遗传。对家系成员进行全面的临床检查、病史采集，经知情同意后采集家庭成员外周静脉血，提取DNA。从中选取三个个体（两个患者一个正常人）进行全基因组外显子测序，筛选该家系白内障的致病基因。用Sanger 测序方法对全基因组外显子测序所得的候选基因在家系内患病和无患病亲属间进行测序验证变异与疾病共分离情况，并对与疾病共分离的基因突变在 194 个无亲缘关系的常染色体显性先天性白内障家系中进一步筛查，以期发现是否有相同突变。利用蛋白免疫印迹、亚细胞定位实验与转录活性分析实验对我们发现的基因突变进行功能学分析。.重要结果： 10003家系是一个常染色体显性遗传家系，该家系的致病基因为PITX3基因上发生的突变A203GfsX106(c.608delC)，该突变导致的白内障临床表型为后囊下白内障。家系10094和10178同样是常染色体显性遗传，其致病基因皆为PITX3-A214RfsX42（c.640_656del)。功能学研究表明:无论PITX3野生型还是突变体都能够在细胞内表达、且PITX3野生型与突变体蛋白均定位在细胞核内，但在荧光素酶转录活性试验中，相比PITX3野生型，这2个突变的转录活性均表现为不同程度的降低。.结论：这是一次在中国常染色体显性先天性白内障人群中对PITX3突变的大范围筛查，本研究中我们找到了2个PITX3突变，其中一个导致了一个四代遗传的先天性后囊下白内障；而另一个则同时在2个常染色体显性先天性白内障家系中被发现，且该突变导致的遗传方式与表型与它最初发现该突变的家系不同。同时，我们的研究表明在中国常染色体显性白内障人群中，由PITX3突变导致白内障的频率为（3/195）。此外，对这2个PITX3突变功能学研究，能够增加我们对于PITX3突变致病机理的了解。本研究将进一步阐明PITX3的功能和机制，为先天性白内障和眼前节发育不良的分子机理和临床治疗提供新的线索。