虾类piggyBac-like转座子对于外源基因的剪切、转座和整合作用研究

piggyBac转座子最先在昆虫中发现并在昆虫转基因技术发展与完善过程中发挥了极其重要的作用。针对经济甲壳动物（主要是虾类）的转基因研究现状，申请人期望借鉴昆虫转基因研究的成功经验，利用piggyBac转座子进行虾类转基因研究从而突破对虾转基因研究原有的技术瓶颈。鉴于此，前期研究中，申请人在中国明对虾中获得了一条编码piggyBac的序列（FcPIG），其与粉蚊夜蛾 piggyBac的相似性达58%。本项目拟在此基础上，获得FcPIG侧翼序列，分析转座酶ORF和反向重复序列；构建供体质粒和辅助质粒，在果蝇S2细胞、对虾原代细胞中验证其剪切和转座活性；在脊尾白虾受精卵中探讨其整合效率及其整合位点的特征。具有转座活性的对虾piggyBac转座子的发现及其在脊尾白虾受精卵中的转基因实现，对甲壳动物的转基因研究以及基于转基因基础上的基因功能阐释、转基因细胞系建立等均具有重要的理论意义。

自课题启动后，课题组收集了大量相关文献资料，并进行了整理，细化了课题任务书中拟定的技术路线和实施方案。在项目执行过程中，取得了一定的研究成果，主要包括：(1)获得了中国明对虾piggyBac基因全长cDNA序列及其基因组序列，并成功构建了以中国明对虾PiggyBac为转座酶以及其上下游反向重复序列为左右臂的质粒FcPiggyBac两侧重复序列的载体；建立了以脊尾白虾为研究对象的海水养殖虾类遗传转化体系，构建了一套在昆虫sf9细胞中验证启动子活性的体系，表达体外转录的mRNA在脊尾白虾胚胎中的显微注射；发掘了大量用于开展虾类遗传转化研究的功能基因，并阐明了其组织表达特征及在发育不同时期的表达特征；在转基因载体的构建及其验证工作方面获得了初步的研究进展，在脊尾白虾中实现了基于CRISPR-cas9的基因组编辑工作，获得了经过CRISPR-cas9处理的脊尾白虾成体。.在项目执行过程中，发表SCI论文6篇，申请国家发明专利2项，圆满完成了项目任务书的目标和要求。