壳寡糖促周围神经再生的研究

神经损伤修复与功能重建是人口与健康领域中的重大课题。本课题拟探讨壳聚糖降解产物壳寡糖促神经再生的生物学作用。分离制备不同聚合度的壳寡糖，免疫组化和Western blot方法确定不同聚合度壳寡糖与促神经元突起生长的生物活性定量关系，并探讨相关信号通路。电生理、组织学、行为学、分子生物学和超微结构分析等方法研究大鼠坐骨神经损伤后，最佳聚合度壳寡糖促神经损伤后修复作用，并探讨壳寡糖促雪旺氏细胞成髓鞘可能的信号通路。MTT，流式细胞仪、BrdU染色、Western blot 和ELISA研究最佳聚合度壳寡糖促雪旺氏细胞增殖和分泌相关神经营养因子的作用。Western blot、免疫组化和电镜技术研究雪旺氏细胞与背根神经节共培养中，壳寡糖促髓鞘形成的作用。通过最佳聚合度壳寡糖对神经元和胶质细胞两方面的作用，探讨壳寡糖促神经再生的机制，为壳寡糖作为神经损伤类疾病的医药产品开发提供科学的依据。

壳聚糖作为良好的生物材料，已成功桥接修复周围神经缺损。本课题利用体外酸降解法将壳聚糖进行降解纯化，得到平均聚合度为7，平均分子量为800，脱乙酰度为97.3%的壳寡糖混合物。壳寡糖再经过亲水作用液相色谱（HILIC）进一步分离，经蒸发光散射检测器（ELSD）检测，得到聚合度分别为2、3、4、5和6的壳寡糖单体（对应的是壳二糖、壳三糖、壳四糖、壳五糖和壳六糖）。将分离得到的不同聚合度壳寡糖在体外培养的背根神经节（DRG）上进行神经元突起生长活性的研究。结果显示：壳三糖促进DRG突起生长的活性最强。Western blot分析壳三糖对DRG神经元中NF-H和GAP-43表达的影响，以及作用过程中ERK通路的影响。结果显示：壳三糖促进了DRG神经元中NF-H和GAP-43的表达，壳三糖促进DRG神经元突起生长可能与ERK1/2通路的激活相关。我们在验证促DRG神经元生长的最佳聚合度壳寡糖时，同时利用MTT法筛选促大鼠施万细胞系(RSC96)和原代大鼠施万细胞活力的最佳聚合度壳寡糖，MTT结果显示：促RSC96细胞和原代施万细胞活力的最佳聚合度壳寡糖为壳三糖。MTT、生长曲线、流式细胞仪和EdU染色法验证壳三糖对原代施万细胞增殖的影响。MTT分析结果显示：壳三糖有效促进了施万细胞的活力。生长曲线结果显示：壳三糖作用施万细胞48h后，促进了细胞增殖。流式细胞仪检测结果显示：与对照组相比，壳三糖剂量组施万细胞的增殖指数显著高于对照组。EdU染色结果显示：壳三糖剂量组施万细胞的EdU阳性细胞数显著高于对照组。Western blot对施万细胞中Cyclin D1、N-cadherin和β-catenin表达的影响。结果显示：壳三糖促进了施万细胞中Cyclin D1、N-cadherin和β-catenin表达。ELISA检测壳三糖对施万细胞分泌NGF、BDNF的影响。结果显示：壳三糖有效地促进了施万细胞中NGF和BDNF的分泌。制备大鼠坐骨神经夹伤模型，通过撤回反射时间、坐骨神经功能指数、腓肠肌湿重比等指标检测壳三糖对大鼠坐骨神经损伤后修复作用。壳三糖促进了神经损伤后修复和功能恢复，并促进了N-cadherin、GAP-43和P75表达。促进神经再生最佳聚合度壳寡糖是壳三糖，壳三糖主要通过促进神经元突起的生长和施万细胞的增殖，促进周围神经损伤后修复。