SNARE蛋白VAMP721和VAMP722参与植物胞吞动态转运的机制研究

SNARE proteins mediate the membrane fusion during the process of vesicle trafficking. Previously, the investigations about the function of plant SNAREs mainly focus on the regulation of secretory trafficking within endomembrane system. However, the roles of SNARE protein in plant dynamic endocytosis are still unclear. In plants, clathrin-mediated endocytosis is the principal route by which cells internalize the transmembrane proteins. In the present study, we will investigate the function of Arabidopsis SNAREs VAMP721 and VAMP722 in plant endocytosis based on our new results by means of dynamic imaging in the living cells together with biochemic and genetic approaches. First, we will determine the roles of SNAREs VAMP721 and VAMP722 in plant endocytic process. Then, the correlation of the dynamics of VAMP721 and VAMP722 at plasma membrane with clathrin-mediated endocytosis will be analyzed. Finally, we will further explore the mechanism for VAMP721 and VAMP722 involved in clathrin-mediated endocytosis. In the course of the investigation, some new methods and techniques including variable angle total internal reflection microscopy, fluorescence correlation spectroscopy and FRET-FLIM, will be used in this study with the aim of uncovering the function of VAMP721 and VAMP722 in dynamic process of plant endocytosis. Taken together, the results of this study will provide new insights into the regulation mechanisms of clathrin-mediated endocytosis and membrane protein function in plant cells.

SNARE蛋白介导囊泡运输的膜融合过程，前人对植物SNARE蛋白参与胞内不同膜区室之间的分泌运输进行了深入研究。然而，SNARE蛋白在植物胞吞过程中的作用尚不清楚。研究表明，网格蛋白介导的胞吞是植物膜蛋白胞吞的主要途径。我们前期的研究结果暗示，SNARE蛋白VAMP721和VAMP722参与植物胞吞作用。为进一步揭示其参与胞吞的机制，本项目以拟南芥为材料，着重展开三方面的研究：(1)分析VAMP721和VAMP722在植物胞吞运输中的功能；(2)研究VAMP721和VAMP722与网格蛋白介导胞吞的相关性；(3)阐明VAMP721和VAMP722参与胞吞的作用机制。在本项目研究中，拟采用可变角度全内反射荧光显微术、荧光互相关光谱和FRET-FLIM等一些新技术、新方法，旨在揭示SNARE蛋白在网格蛋白介导的植物胞吞动态过程中的作用，为进一步研究植物胞吞机制和膜蛋白活性调控提供新的依据。

网格蛋白介导的胞吞是植物细胞中一种重要的胞吞方式，参与调控许多重要膜蛋白的运动和活性。目前，有关植物胞吞运输机制的研究主要集中在网格包被蛋白，接头蛋白复合体亚基的鉴定与功能分析。研究表明，在神经突触细胞和真菌菌丝中，SNARE蛋白也参与胞吞作用。然而，植物细胞中参与质膜胞吞运输的SNARE分子尚不清楚。本项目主要研究了拟南芥R-SNARE蛋白VAMP721和VAMP722在胞吞运输中的功能。研究结果表明，蛋白质合成抑制剂CHX处理下，胞吞标记物FM4-64与胞质中的GFP-VAMP721/722标记的内吞体共定位。与野生型拟南芥相比，vamp721vamp722突变体严重抑制了根细胞对FM4-64的胞吞吸收，表明VAMP72蛋白与植物胞吞运输相关。在共聚焦显微镜下观察发现，GFP-VAMP721/722与CLC2-mCherry共定位。利用CHX预处理以及网格蛋白胞吞抑制剂TyrA23和囊泡运输抑制剂BFA共处理表明，阻断网格蛋白胞吞途径严重抑制了VAMP721/722从质膜上胞吞形成BFA聚集体。进一步通过clc2clc3突变体背景下分析GFP-VAMP721/722在CHX处理后BFA聚集体的形成，表明网格蛋白胞吞途径参与VAMP721/722的胞吞运输。通过BiFC和co-IP证明，VAMP721与胞吞相关蛋白AtECA4互作。然而，Ateca4突变体不影响FM4-64的胞吞，可能与其它成员功能冗余。CLC2亚细胞定位分析表明，与野生型相比，CLC2-mCherry在VAMP72突变体根细胞中聚集。此外，蛋白互作分析证明SYP22与VAMP727与BRs受体BRI1互作。过表达SYP22胞质区（SYP22ND）抑制拟南芥的生长，对外源BRs处理不敏感。SYP22ND影响了BRs合成和信号传导途径的基因表达，以及与VAMP727/BRI1的互作定位。蛋白定量分析表明SYP22ND降低了BR11的质膜密度。胞内转运分析表明SYP22ND抑制了BRI1的胞吞循环运输，进而影响质膜定位。上述研究结果揭示了VAMP721与VAMP722通过网格蛋白介导的胞吞途径进行胞吞运输，其功能维持了网格包被蛋白的正常定位；为进一步研究SNARE蛋白介导植物功能膜蛋白胞吞循环运输以及探索SYP22-VAMP727与VAMP721/722之间的功能联系奠定基础。