IL1RAP 嵌合受体T 细胞疫苗抗慢性髓系白血病干细胞的研究

Chronic myeloid leukemia (CML) is a great threat to people's health and life.All of the therapies against CML still have shortcomings, which can not eliminate leukemic stem cell (LSC) leading to the relapse of CML. The key step of therapy for CML is specific cleaning of LSC. Recently it is reported that the specific surface marker to distinct LSC and normal haemopoietic stem cell (HSC) is IL1RAP. Furthermore, the antibody of IL1RAP can effectively lysis leukemic cell lines and LSCs in CML patients. However, there are many limitations in utilization of IL1RAP antibody, including neutralization by soluble IL1RAP in plasma, necessity of persistent injection and lack of immunologic surveillance to neo-tumor cells. In this project, we will design an IL1RAP chimeric antibody receptor(CAR) T cell vaccine which can recognize LSC in a specific and non-MHC restricted pattern. Meanwhile, we will illuminate the influence produced by IL1RAP-CAR T cell vaccine to LSC, as well as the function properties of T cell vaccine. As scheduled, it will verify the novel target to eliminate LSC and will provide precious information to cure CML.

慢性髓系白血病（CML）是一种严重威胁人类健康和生命的疾病，目前临床中各种治疗方法均存在缺陷，不能有效清除白血病干细胞（LSC）是导致疾病复发的根源之一。特异性杀伤LSC是CML治疗的关键。最新研究表明，IL1RAP是区分CML中LSC和正常造血干细胞（HSC）最特异的表面标志。研究证实虽然IL1RAP抗体能杀灭白血病细胞系及CML患者体内的LSC，但IL1RAP抗体可被血浆中可溶性IL1RAP中和而失效，需持续应用且不能对新发LSC起免疫监视作用。本课题拟构建通过非MHC限制性途径识别LSC的IL1RAP嵌合受体(CAR) T细胞疫苗，经体外及体内实验，证实CAR-T细胞疫苗杀伤CML细胞系效果及在体内对LSC生物学行为影响，阐明疫苗自身的功能特征及杀伤机制。如期完成，可通过使用本疫苗有效清除CML中LSC，为CML的临床治疗提供新途径。

IL1RAP 是最新鉴定的CML 中LSC 的细胞表面特异标志。本研究设计新型的携带scFv-anti-IL1RAP-CD137-CD3ζ-TK 的CAR-T 细胞疫苗，使T 细胞直接识别、活化并杀伤IL1RAP+ LSC，而且发挥细胞疫苗能形成记忆细胞优势的同时避免抗体应用的缺陷。在该项目的资助下我们完成了项目任务书中的内容，并新发现了IL1RAP表达水平与CML疾病分期进展的相关性。具体研究结果概述为（1）IL1RAP蛋白在CML病人的干细胞和祖细胞表面表达上调，且其在干细胞上的表达与BCR-ABL融合基因及Ph染色体的形成密切相关。进一步研究发现，CD34+CD38-干细胞表面IL1RAP的表达水平随CML疾病进展升高，与疾病分期相关。（2）成功获得了8株可稳定分泌IL1RAP单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别为3H6E10、4B6A6、8G11B5、9E9F2、10D8A7、1C7H7、1D7G11和2D3D3，抗体类型鉴定为IgG1/κ型，分泌的单克隆抗体能特异性识别单个核细胞表面的IL1RAP蛋白。（3）获得两种抗人IL1RAP McAb的VH及VL基因，3H6E10 VH和VL基因全长402 bp和393 bp；10D8A7 VH和VL基因全长423 bp和381 bp。构建重组表达载体LV-3H6E10 scFv-ICD、LV-10D8A7 scFv-ICD（ICD: CD8α跨膜段-CD137胞内段-TCR ζ链）后，经测序证实目的片段大小正确。重组质粒转染293FT细胞获得表达IL1RAP的慢病毒，慢病毒感染正常人外周血T细胞后成功获得IL1RAP嵌合受体T细胞疫苗。（4）IL1RAP特异性的CAR-T细胞与白血病细胞KU812共培养，LV-Gene组（CAR+-T+KU812）细胞增殖明显低于BC组（正常T细胞+KU812）和LV-Ctrl组（CAR-T+KU812），两组间比较差异有统计学意义。（5）白血病细胞凋亡实验表明，且LV-Gene组KU812细胞早期凋亡率明显高于白血病细胞组和LV-Ctrl组，差异有统计学意义。综上，在此项目中我们阐明了IL1RAP作为慢性髓系白血病干细胞的表面标志随CML分期表达升高；成功构建了能特异性结合IL1RAP蛋白的嵌合受体T细胞疫苗，且可特异性杀伤高表达IL1RAP的白血病细胞。