基于免疫磁性微球的苹果汁中嗜酸耐热菌快速分离与富集理论方法

中国是世界最大的浓缩苹果汁生产国，贸易量占世界的50%以上，而以嗜酸耐热菌为代表的安全性指标是其国际化发展的"绿色技术壁垒"之一，对嗜酸耐热菌的快速分离是其检测和控制中的技术瓶颈，因此，寻求一种高效、快速的嗜酸耐热菌分离与富集方法是目前产业研究的热点。本项目通过嗜酸耐热菌在大耳白兔的免疫表达，获得嗜酸耐热菌的特异抗体；通过磁性微球表面结合特异抗体制备免疫磁性微球，使其在苹果汁中特异性结合嗜酸耐热菌，并在外加磁场作用下定向移动，将嗜酸耐热菌快速分离；通过化学构成解析和特异性抗体的结构分析，定向选择抗体与磁性微球表面的结合位点与部位，揭示嗜酸耐热菌与免疫磁性微球特异结合的分子机制，确定方法的有效性、特异性及最佳分离范围，系统构建基于免疫磁性微球的苹果汁中嗜酸耐热菌快速分离与富集理论方法，全面支撑苹果汁中嗜酸耐热菌快速分离与基于PCR、ELISA、FT-IR/NIR检测样品的快速制备技术体系。

脂环酸芽孢杆菌是苹果浓缩汁产业中关键的质量安全因子之一，对果汁的生产加工及出口贸易构成了严重威胁。本研究以脂环酸芽孢杆菌多克隆抗体及免疫磁性微球制备为基础，建立了免疫磁性分离体系，实现了脂环酸芽孢杆菌快速分离及检测：.（1）制备获得了脂环酸芽孢杆菌多克隆抗体：两只新西兰大白兔免疫获得的多克隆抗体浓度分别为27.8 mg/ mL和20.8 mg/ mL；抗体的分子量为150 kDa；抗体效价为40000。制备的多克隆抗体有非常好的识别特异性。.（2）通过功能化磁性微球中胺基基团与抗体中醛基基团的定向反应制备获得的免疫磁性微球具有最高的生物活性和最佳的脂环酸芽孢杆菌分离效果。同时，通过分析与表征多克隆抗体功能结构及磁性纳米微球化学构成，解析了磁性纳米微球与多克隆抗体结合部位与作用位点，揭示了脂环酸芽孢杆菌与免疫磁性微球特异性结合分子机制。.（3）磁性纳米微球对多克隆抗体的最大固定化量为75.6 μg/mg，反应时间60 min；以含有5% BSA和0.05% Tween-20的PBS缓冲液混合体系对免疫磁性微球封闭处理60 min即可有效提高免疫捕获-分离体系的特异性。构建的免疫磁性分离技术体系中，免疫磁性微球用量2.5 mg/mL，免疫捕获时间30 min，在此条件下对菌体浓度104 CFU/mL样品的分离率达到80%以上。.（4）通过免疫磁性分离技术（IMS）与ELISA检测结合，构建了IMS-ELISA技术方法体系，实现了苹果汁中脂环酸芽孢杆菌的快速检测，其灵敏度为103 CFU/mL，检测时间3 h。免疫捕获-分离富集技术体系可以有效提高ELISA方法的检测灵敏度。.（5）构建了基于IMS-PCR方法的苹果汁中A. acidoterrestris 检测技术体系，其检测灵敏度为10 CFU/mL，检测时间3-4 h。通过对苹果汁样品检测结果表明，建立的IMS-PCR技术方法体系特异性强、灵敏度高、检测速度快，可以用于苹果汁中A. acidoterrestris的快速检测。.因此，通过本项目的实施，构建了苹果汁中脂环酸芽孢杆菌快速分离及检测技术体系，为苹果汁生产加工及国际贸易中脂环酸芽孢杆菌的快速识别提供了理论方法和技术支持。