杜鹃红山茶四季成花的基因表达谱研究

Camellia azalea, a rare species of flowering in all-season and blooming in summer in Camellia, is the precious germplasm resource for breeding new all-season flowering Camellia varieties. Because Camellia azalea is flowering in whole year at warm zone but no flower in winer at cold zone, we collected the leaves and flower buds of before and after differentiation, four seasons at warm zone and two climate zone in winter as experimental samples. The transcriptome will be sequenced by next-generation sequencing technology (RNA-Seq) and classified according to their function by bioinformatics. The related genes involved in flowering inducing pathway will be found by multiple alignment after analyzing the differentially expressed of transcriptome before and after flower bud differentiation and under different climate condition.The full-length sequnence of key genes will be isolated by 5',3' RACE. The expression of key genes will be analyzed at different organs, climate zone, season and developmental stages by RNA in situ hybridization and qRT-PCR and their functions will be identified. We expect to find the gene regulatory networks involved in flowering inducing pathway of Camellia azalea, which will provide an initial theorotical foundation for clasifying molecular mechanisms of flowering in whole year of Camellia azalea.

杜鹃红山茶是山茶属植物中极少数四季开花、夏季盛花的物种，是培育四季开花茶花新品种的宝贵亲本资源。本研究针对杜鹃红山茶在温暖地区四季开花、冬季寒冷地区冬季不开花的现象，以花芽分化前后、寒冷地区四季、冬季不同地区的杜鹃红山茶叶片和花芽为材料，采用RNA-Seq技术进行转录组测序，利用生物信息学分析软件对转录组进行功能注释和分类，通过多重对比，分析转录组在花芽分化前后和不同气候条件下的差异表达，筛选参与杜鹃红山茶成花诱导途径的相关基因，采用5'、3'RACE克隆几个关键基因的全长，通过RNA原位杂交和荧光定量PCR研究关键基因在不同组织、不同气候区、不同季节及不同发育时期的表达差异，从而鉴定杜鹃红山茶成花诱导过程中关键基因的功能，检测杜鹃红山茶成花诱导的基因调控网络，为阐明杜鹃红山茶四季成花的分子机制提供前期理论基础。

杜鹃红山茶是目前发现的280多个山茶原种中极少数能四季开花、夏季盛花的宝贵物种，是培育山茶四季开花新品种的首选亲本资源。通过同源克隆方法分离参与成花诱导的相关基因并检测成花诱导基因调控网络，对山茶属植物这样的木本非模式植物来说非常困难。在山茶属植物全基因组测序尚不能开展且转录组信息未公开的情况下，RNA-Seq技术非常适合分析杜鹃红山茶基因表达研究。.本研究针对杜鹃红山茶以杜鹃红山茶花芽、四季的叶片及花芽为材料，结合RNA-Seq测序技术，分析成花诱导过程中的转录组表达差异，分离与成花诱导过程相关的关键基因，并对关键基因在不同组织、不同发育阶段表达进行研究，分析开花基因在杜鹃红山茶成花诱导中的作用，项目经过三年的研究探索，主要有以下结果：.（1）调查了杜鹃红山茶花芽发育中花器官的发生、形成与成熟过程，确定了3个重要的关键时期，花芽器官起始生长期（S1）、花芽器官原基发生期（S2）、花芽器官生长期（S3），并找出了发育阶段与外部形态的相关性，及花芽器官起始生长期为0.3-0.4cm，花芽器官原基发生期为0.5-0.6cm，花芽器官生长期为0.8cm。.（2）对杜鹃红山茶不同时期花芽的转录组进行测序，通过 Trinity组装共得到213,316条Transcripts和79,363条Unigenes，使用BLAST软件将Uingenes序列与NR、Swiss-Prot、GO、COG、KEGG数据库比对，获得了32999条Unigenes功能注释。.（3）开展了杜鹃红山茶花芽三个关键发育时期的表达谱测序，得到了84.75 M reads，其中S2到S3时期基因表达差异较大，对S1-S3、S2-S3而非S1-S2的3415个差异基因功能分析，主要涉及了冷诱导、光信号、雄蕊发育等过程，激素的代谢过程。.（4）从差异表达基因中筛选了15个与花芽形成及发育相关的基因，其表达模式基本与杜鹃红山茶花芽发育的状态相符；克隆了2个杜鹃红山茶花芽发育的关键基因FT、TFL1，FT基因在2/3月和5月有两个表达高峰，TFL1基因花芽越大表达量越高，最大差异在22倍左右。.（5）根据转录组及表达谱信息对已知开花基因进行组建，初步构建了杜鹃红山茶开花调控分子网络，为诠释杜鹃红山茶四季开花分子机理提供佐证。.本项目为探索杜鹃红山茶四季开花的分子调控途径，培育四季开花的茶花新品种提供前期理论依据。