玉米种子低温出苗QTL（qCTG1）的图位克隆和功能研究

Seed damage from cold environments greatly threat to maize production in Northeast China. Utilization of seed with high cold test germination (CTG) contributes to high seedling emergence, uniform seedling establishment as well as grain yield in maize. In addition, variety with high CTG seed can be planted in north area and extend the national field. A low CTG inbred line (PH4CV) were crossed to two high lines (220 and P9-10) to generate F2:3 populations. Five seed related traits (emergence rate, ER; germination index, GI; seedling root length, RL; shoot length, SL; and total length, TL) were investigated under 10 ℃ environment. Together with 6K SNP chip, a total of 37 QTLs was identified for above five traits in two populations. A consensus QTL on chromosome Bin1.06 (qCTG1) could be detected for several traits from both populations, which had a high contribution of phenotype variation. Using BC2F2:3 population derived from 220×PH4CV, fine-mapping narrowed qCTG1 to a chromosome region of 908 kb, where contained 11 putative genes. In this project, fine-mapping will be conducted to further narrow down qCTG1 by using residual heterozygous line derived from the BC population. When narrowed to no more than 5 genes, mu mutant lines and transgenic lines were generated to confirm the candidate gene function. Mechanisms of candidate gene involved were further investigated in improving cold germination ability in maize seed.

提高种子低温出苗能力可以降低北方玉米生产存在的早春低温坏种风险，获得良好出苗和稳产；还可以实现品种往更北积温带推广、延伸播种面积。我们利用1个低温出苗敏感型自交系（PH4CV）和2个耐受型系（220和P9-10）组配F2:3群体，在10℃下调查了5个种子低温出苗相关性状；结合6 K单核苷酸多态性（SNP）芯片，QTL定位获得37个位点。在Bin1.06处发现一个在两个群体中同时被定位到、表型贡献率高、控制多个性状的主效QTL（qCTG1）。利用BC2F2:3群体进行精细定位，将qCTG1锚定在908 Kb区间，内含11个候选基因。本项目将利用BC2F2:3群体的杂合单株，通过剩余杂合性继续对qCTG1精细定位，缩小区间并获得候选基因；再结合mu突变体和转基因技术验证基因功能，以及利用基因表达模式和互作基因筛选等手段分析qCTG1基因在玉米耐低温出苗过程中的作用机制和育种价值。

提高种子低温出苗能力可以降低北方玉米生产经常遭受的早春低温出苗率低的风险，获得良好出苗和稳产；还可实现品种往更北积温带推广和延伸播种面积。我们利用低温出苗敏感型自交系（PH4CV）和耐受型系（220）组配F2:3群体，在10℃下调查了5个种子萌发性状；结合6K SNP芯片，QTL定位到一个主效位点（qCTG1），它能被多个性状同时定位到且表型贡献率超过20%。然后构建BC2F2和BC3F2群体，利用22400个单株将qCTG1精细定位到107Kb，内含3个基因。我们获得两个ORF2的Mu插入突变体（zmltg1-1和zmltg1-2），发现在常温25℃、适度低温18℃和极低温10℃条件下，它们的萌发率、胚根干重、萌发指数均低于野生型，而平均萌发时间长于野生型。创建1个ORF2的过表达转基因株系OE1，在上述三个温度下的各萌发性状均优于姐妹对照系NT1。同时发现ORF1的敲除和ORF3的突变都不改变种子萌发性状。因此确定ORF2为qCTG1的功能基因。进化树和表达分析发现ORF2编码一种G type植物凝集素类受体蛋白激酶，定位于细胞膜，在大多数组织中均有表达，在萌发种子胚中的表达量高于胚乳，在种胚中的表达受低温诱导，但在220和PH4CV中没有明显表达差异。通过序列比对发现，与B73相比，220在ORF2的ATG上游398bp处有1839bp的未知插入片段，PH4CV在上游600bp处有2112bp的LTR转座子插入片段，但两个材料的启动子活性没有差异；在CDS区有4个SNP变异，其中2个导致氨基酸序列改变。利用Mu突变体、过表达株系及近等基因系进行低温萌发转录组分析，发现刺激响应相关途径基因，如热激蛋白和ROS相关蛋白的编码基因等被明显富集。总之，本项目克隆到一个控制玉米种子低温萌发的主效QTL基因ORF2，该基因在各组织中组成型表达，在萌发种子中受低温诱导表达；基因突变会导致热激蛋白和ROS等刺激响应蛋白被富集。这些结果为改良玉米种子低温出苗和东北玉米早春播种出苗提供基础信息和有用基因资源，但详细的导致双亲表型差异的功能变异以及基因功能机理还需要后续研究。