自噬受抑制对耳蜗细胞及听力损伤的作用研究

Autophagic distribution and physiology in fibrocyte of lateral wall, spiral ganglion neuron, and hair cell of the organ of Corti, especially, the roles of autophagic inhibition in hearing loss are unknown and not reported yet. In the preliminary experiment, our research team successfully established cell and animal models by chloroquine to simulate autophagic deficency. We found that expression of autophagy related protein LC3 was increased after autophagic inhibition in auditory cell line HEI-OC1 (P < 0.05) compared to control group. Hearing loss was dectected in SD rats. These data revealed that autophagy is essential to cells in the organ of Corti. Combined the roles of autophagy in physiology with the data of our preliminary study, we hypothesize that “inhibition of autophagy may interrupt the homeostasis of the organ of the Corti, induce apoptosis, resut in hearing loss”. To verify this hypothesis, chloroquine will be involved in high and low dose to treat cell and make organ-specific autophgic deficency animal model to compare with normal control and positive control made by treatment of autophagic inducer rapamycin. To explore the mortality and LC3 expression in different level of autophagic inhibition. To shed light on the roles of autophagic Inhibition in hearing loss along with the clue that autophagic inhibition - apoptosis of the cells in the organ of the Corti - hearing loss. Those findings may be contribute to new clinical strategies to alleviate or prevent ototoxicity by manipulating autophagy.

自噬在耳蜗侧壁、螺旋神经节细胞和毛细胞中的分布及其生理作用，特别是耳蜗细胞的自噬活动受抑制是否参与听力损伤，尚未见报道。在前期研究中，课题组利用氯喹抑制了HEI-OC1细胞和大鼠耳蜗结构中的自噬活动。发现听力细胞株的自噬相关蛋白（LC3）表达增强（P < 0.05），大鼠听力功能受损。提示自噬对维持大鼠耳蜗功能很重要。综合自噬在细胞中的生理作用及前期研究，提出“自噬活动抑制能够打破耳蜗细胞的生理稳态，引起耳蜗听力细胞凋亡，导致听力功能损伤”。本课题拟使用自噬抑制剂氯喹分别处理HEI-OC1细胞和大鼠耳蜗，以自噬诱导剂雷帕霉素作为对照。观察在自噬抑制下，听力细胞生存及LC3的表达情况，大鼠的听力功能、耳蜗侧壁纤维细胞、螺旋神经节细胞及毛细胞的生存和LC3的表达情况。以自噬受抑制—听力细胞凋亡—听力传导障碍—听力功能损伤为切入点，阐明自噬在听力功能受损中的作用，为听力功能受损的防治提供新途径。

本研究按原计划开展相关实验，并取得预期结果；在此基础上，探讨了新冠肺炎用药方案氯喹（CQ）联合阿奇霉素（AZM）的潜在耳毒性的自噬机制；初步证实自噬机制对毛细胞纤毛簇的维护有重要作用。实验结果表明：CQ处理HEI-OC1听力细胞株24小时引起显著的自噬相关蛋白（LC3B）的累积，致52%的细胞死亡率。进一步用CQ处理体外培养的出生后三天小鼠的耳蜗基底膜24小时，发现毛细胞中LC3B显著累积，出现外毛细胞（OHC）缺失；RPM处理组未出现毛细胞缺失。再次验证自噬抑制打破毛细胞生理稳态，导致毛细胞的调亡。体内实验通过鼓膜内分别注射RPM与CQ发现：RPM组未出现听力损伤；CQ处理组出现剂量依赖的听力损伤效应；低剂量CQ组出现OHC的损伤，未出现显著的螺旋神经节细胞（SGC）及侧壁纤维细胞（F-LW）的损伤，高剂量CQ组出现显著的OHC，SGC，及F-LW的损伤。上述结果表明：自噬机制作用于OHC，SGC，和F-LW三个靶点的细胞，对三种细胞的生理稳态的维持均有重要意义。鉴于有报道提出CQ联合阿奇霉素（AZM）对新冠肺炎有效，但是其潜在的耳毒性未有报道，课题组基于本项目的数据推测使用CQ治疗会通过抑制自噬对耳蜗功能造成损伤，和AZM联合使用对听力功能有潜在的协同损伤作用。课题组将实验动物分成对照组，CQ组，AZM组，及AZM+CQ组，发现CQ组出现32和16kHz两个频率的听力损伤；AZM组只有32kHz出现损伤；AZM+CQ组引起的听力损伤显著高于CQ和AZM组。对OHC、SGC和F-LW的形态学和LC3B的评估发现：AZM组仅OHC出现损伤伴LC3B的累积，CQ组中三种细胞均出现损伤，和前面实验结果一致， AZM+CQ组中三种细胞均出现明显损伤，相关靶点有显著的LC3B的累积。初步得出结论，CQ通过抑制自噬引起靶点细胞的凋亡，出现听力损伤，AZM主要通过对OHC的影响引起听力损伤，CQ和AZM联合有协同听力损伤作用。同时课题组还发现：CQ组OHC纤毛簇出现紊乱及纤毛缺失和融合，值得进一步探讨自噬维护纤毛簇的机制。后续课题组拟进一步筛选对自噬有诱导作用的中药单体成份，进行其对耳蜗保护作用的探讨。