鱼类TRIM16家族基因TRIM16a负调控干扰素抗病毒免疫反应的功能研究

Curcian carp Carassius auratus TRIM16a is a homologue of human TRIM16. Our preliminary studies have shown that in viral-infected fish cells fish TRIM16a is significantly induced and negatively modulates RLR-mediated interferon antiviral immune response possibly targeting protein kinase TBK1; however, the detailed mechanisms remain to be investigated. In the current research, firstly, the 5’ flanking sequences of crucian carp TRIM16a gene will be cloned to compare the induction pathways triggered by different interferon stimuli, thus clarifying how this gene is transcriptionally expressed in response to virus infection. Secondly, the dynmics of subcellular co-localization of fish TRIM16a protein and its targeting protein TBK1 will be studied in order to reveal where this gene exerts its function upon virus infection. Finally, the ubiquitination and degradation of TBK1 by crucian carp fish TRIM16a and the resultant interferon gene expression are determined in vitro and also in vivo by CRISPR/Cas9 gene editing zebrafish, further clarifying how fish TRIM16a negatively regulates interferon antiviral response upon viral infection. If this research is supported, the functional role of fish Trim16a and the underlying mechanisms involved in fish interferon antiviral immune response will be revealed, and importantly, these results will aid to comprehensively understand fish-own regulatory mechanisms of interferon antiviral response by fish TRIM16a gene.

鲫TRIM16a是人TRIM16的一个同源基因。前期研究表明鲫TRIM16a在病毒感染的细胞中负调控宿主的干扰素抗病毒免疫反应，作用底物可能为蛋白激酶TBK1，但是其中的分子机制有待深入研究。本项目首先将分离鉴定TRIM16a基因的侧翼调控序列，研究病毒诱导TRIM16a表达的信号通路，揭示TRIM16a在病毒感染时如何被启动表达。进而研究TRIM16a基因编码蛋白与底物TBK1在病毒感染细胞中的动态共定位规律，揭示TRIM16a在干扰素抗病毒反应中发挥功能的场所。最后研究TRIM16作用TBK1的分子机制以及对干扰素表达的调控差异，并结合斑马鱼模型利用CRISPR/Cas9基因编辑技术开展体内研究，解析TRIM16a基因如何负调控干扰素抗病毒反应。本项目的研究结果不仅将阐明TRIM16a在干扰素抗病毒反应中的功能角色以及作用机理，而且有助于理解鱼类具有自身特点的干扰素抗病毒反应调控机制。

TRIM家族是一类由含RING结构域蛋白组成的E3泛素连接酶家族。鱼类也存在保守的抗病毒免疫反应机制及TRIM家族。在本研究中，我们从病毒感染的鲫囊胚培养细胞（Crucian carp C. auratus blastula embryonic cells，CAB）中，克隆了一个TRIM同源基因，最初命名为鲫TRIM16a。系统进化树分析表明该基因属于finTRIM家族成员，可能是鲫物种特异的基因，因此我们将该基因命名为FTRCA1（fish novel TRIM Carassius auratus 1）。表达调控分析揭示FTRCA1是一个典型的ISG。过量表达和敲降该基因后发现，FTRCA1抑制poly(I:C)介导的IFN反应，同时伴随转录因子IRF3磷酸化水平的减弱。虽然FTRCA1抑制RIG-I、MDA5、MITA、TBK1对鱼类IFN启动子的激活作用，但有趣的是，对于调控干扰素基因表达的两个重要转录因子IRF3和IRF7，FTRCA1只负调控IRF7介导的IFN基因的表达。机制研究表明，FTRCA1对TBK1基因的转录没有影响，但是却促进TBK1蛋白通过溶酶体途径降解TBK1、从而抑制TBK1诱导的IFN反应。FTRCA1能被TBK1磷酸化，但FTRCA1是否被磷酸化并不影响其促进TBK1蛋白降解的功能。进一步研究证实，FTRCA1是一个E3泛素连接酶，其E3酶活性对发挥负调控功能至关重要。与负调控TBK1介导的IFN反应不同，FTRCA1通过某种转录后调控机制促进IRF7 mRNA降解，从而影响IRF7蛋白水平，最后抑制IRF7介导的IFN反应。我们的研究结果表明FTRCA1可以靶向信号通路中不同信号分子在蛋白水平和RNA水平上的降解、从而负调控鱼类的IFN反应。由于FTRCA1是一个鲫物种特异的finTRIM成员，因此，我们的研究结果也揭示了具有物种特异的鱼类干扰素反应的调控机制。