Msx1通过调控其早期靶标基因控制肌肉前体细胞分化

Msx1 homeoprotein plays a crucial role in mediating epithelial-mesenchymal signaling during embryonic patterning. It prevents terminal differentiation of myogenic precursor cells through mediate the expression of target genes. While, the target genes, especially early response target genes for Msx1 were poor understood. Identification of Msx1 early-response target genes, and the interaction between Msx1 and target genes will be helpful to understand the biological function of Msx1 in myogenic precursor cells. This study will focus on: 1) identification of early response genes regulated by Msx1; 2) identification of Msx1 binding sites on early response target genes; 3) detection of interaction between Msx1 and early response target gene. The findings will help us to understand the molecular roles of Msx1 during myogenesis, further to understand the biological function of Msx1 in epithelial-mesenchymal interaction signaling and provide broad insights into the molecular mechanisms underlying homeoprotein functions in development.

在胚胎发育过程中同源异型框蛋白Msx1在介导上皮细胞和间质细胞之间的信号传导中起着关键的作用。Msx1通过调控其靶标基因的表达抑制肌肉前体细胞的终端分化。但是人们对Msx1靶标基因尤其是Msx1的早期反应靶标基因了解甚少。鉴定Msx1的早期反应靶标，以及Msx1与其靶标基因间的相互作用将有助于理解Msx1在肌肉前体细胞中的生物功能。因此本项目拟进行以下几方面研究：在肌肉前体细胞中Msx1早期靶标基因的鉴定；Msx1在其早期靶标基因上结合位点的鉴定；以及Msx1与其早期靶标基因之间的相互作用。该研究将阐明Msx1在肌肉前体细胞中对其靶标基因调控的分子机制。研究结果将帮助人们了解Msx1肌肉前体细胞中的精细分子作用, 为了解肌肉相关疾病的发生提供坚实的理论基础，同时有助于了解同源异型框蛋白在发育过程中的分子作用机制。

本项目在肌肉前体细胞中鉴定了Msx1早期靶标基因以及Msx1在其早期靶标基因上结合位点；详细阐明Msx1与通过与其互作蛋白形成复合调控其早期靶标基因的表达。完成了Msx1早期靶标基因的鉴定：定出94个Msx1的早期反应靶标基因（P<0.001)，其中44个上调基因（抑制基因），50个上调基因（活化基因）。通过分析Msx1在靶标基因的结合序列，我们发现除了结合基序TAAT外，在TAAT两侧的序列没有保守性。说明Msx1对其早期靶标基因的调控不是通过其结合的DNA序列特异性，可能是通过和互作蛋白一起调控靶标基因。我们发现Msx1通过与Pkn1相互作用调控靶标基因的表达从而调控肌肉分化。在成肌细胞中利用蛋白免疫共沉淀发现Msx1与Pkn1在体内外均存在相互作用。在Msx1过表达的成肌细胞中敲除Pkn1后细胞出现明显的分化现象，说明Pkn1参与Msx1抑制成肌细胞分化。同时，通过细胞周期以及增殖检测均发现敲除Pkn1的细胞增殖能力降低。进一步的RNA-Seq分析发现在Msx1过表达的细胞中，Pkn1的敲除导致Msx1靶标基因Myf5表达升高。进一步实验发现Pkn1是通过协助Msx1在肌肉分化关键调控基因Myf5上的富集以及参与Msx1的亚细胞核定位来实现对肌肉分化的抑制。该研究阐明Msx1在肌肉前体细胞中对其靶标基因调控的分子机制。研究结果帮助人们了解Msx1肌肉前体细胞中的精细分子作用, 为了解肌肉相关疾病的发生提供坚实的理论基础，同时有助于了解同源异型框蛋白在发育过程中的分子作用机制。