Pseudomonas sp. HF-1新尼古丁降解质粒pMH1的分子机制阐明与完善

利用微生物降解尼古丁，具有保护人类健康、保护环境的巨大社会意义和经济意义。本课题组前期筛选到一株尼古丁降解菌Pseudomonas sp. HF-1，并通过质粒转化实验确定尼古丁降解基因位于质粒pMH1上。与同属尼古丁降解菌株S16相比，菌株HF-1中缺少菌株S16的尼古丁降解关键酶编码基因nicA，且在尼古丁降解基因簇中存在3个未知功能基因。中间产物检测也显示菌株HF-1降解尼古丁过程中不存在由尼古丁氧化还原酶NicA作用生成的N-甲基麦喔斯明。降解基因序列信息与中间产物检测都说明菌株HF-1存在有不同于菌株S16转化尼古丁为3-琥珀酸嘧啶（SP）过程的基因与代谢酶。本课题拟在已获得质粒pMH1全序列和功能注释的基础上，鉴定质粒上编码尼古丁转化为SP的功能基因，并通过体外表达、构建突变株等手段阐明参与尼古丁降解的关键基因功能；阐释菌株HF-1降解尼古丁的生物学机制。

尼古丁是烟草中主要生物碱，早在20世纪30年代就有从环境样品中分离可降解尼古丁微生物的报道，随后由于人们对尼古丁污染严重性的关注，越来越多的尼古丁降解微生物被发现。这些微生物均能以尼古丁为惟一碳氮源和能源进行生长，因此可用来处理烟草废弃物等环境污染物。目前主要有4种尼古丁降解途径，分别为以嗜烟碱节杆菌为代表的吡啶途径、以假单胞菌为代表的吡咯途径、脱甲基途径和一种吡啶、吡咯途径的变体途径。另外在一株变形假单胞菌种发现了一条特殊的尼古丁代谢途径。.本项目主要研究尼古丁降解菌Pseudomonas sp. HF-1响应尼古丁胁迫的代谢组学、菌株HF-1对烟草废弃物污染土壤的生物修复、尼古丁降解菌筛选及其代谢途径鉴定和尼古丁降解菌Sphingomonas sp. TY降解尼古丁的分子机制。.使用标准Noesypr1D脉冲序列采集了不同尼古丁浓度培养条件下菌株HF-1的一维1H NMR谱及一系列2D NMR谱。通过光谱分析、数据处理及多元数据分析表明，菌株HF-1代谢组主要包括42种代谢物，其中包含8种脂肪酸、6种氨基酸、3种糖类和11种核苷，且可证明基于NMR的代谢组学技术能为代谢物水平上的尼古丁应激响应提供有效方法。高浓度尼古丁不仅使细菌生长对数期滞后，且减缓了核苷酸的生物合成。同时，尼古丁造成葡萄糖分解代谢水平下降，琥珀酸积累量增加，且严重干扰渗透调节和复合抗氧化作用。另外，尼古丁也可能引起基因、转录和蛋白水平上的改变。.在尼古丁降解菌TY基因组序列中发现一段31 kb尼古丁降解基因簇ndp，编码的尼古丁降解酶与其他已知酶氨基酸序列不一致，且降解基因排列十分紧凑。ndp中包括尼古丁脱氢酶、6-羟基尼古丁氧化酶、吡啶吡咯途径转折点酶、6-羟基-3-琥珀酰吡啶羟化酶及下游代谢途径其他所有酶，同时在ndp基因簇中还编码了一个尼古丁运输相关的膜蛋白，这是发现的第一个与尼古丁运输相关膜蛋白。在基因组中还发现了两簇与尼古丁脱氢酶相关的基因参与菌株TY降解尼古丁的第一步脱氢反应。初步鉴定6-羟基尼古丁氧化酶NdpB、转运相关膜蛋白NdpT及两簇与尼古丁脱氢酶相关基因。.本项目阐明了尼古丁对微生物代谢组的影响并对进行了生物修复工作，同时发现了一个新尼古丁代谢基因簇，及第一个与尼古丁运输相关的膜蛋白。本项目研究成果为尼古丁污染治理提供了科学依据，也为尼古丁代谢的基础研究做出贡献。