雄激素受体介导肉苁蓉活性成分激活内皮细胞PI3K/Akt/eNOS通路生成NO机制的研究

基本信息
批准号:81503333
项目类别:青年科学基金项目
资助金额:18.00
负责人:古励
学科分类:
依托单位:中山大学
批准年份:2015
结题年份:2018
起止时间:2016-01-01 - 2018-12-31
项目状态: 已结题
项目参与者:刘昕,连丹虹,郑一梅,沈冬秀,梁昱
关键词:
肉苁蓉雄激素受体PI3K/Akt/eNOS信号通路勃起一氧化氮
结项摘要

The erectile function can be enhanced by Cistanche for the phytoandrogenic effect involved with androgen receptor (AR), but the precise mechanism has not been illuminated. Nitric Oxide (NO) is an important factor to maintain erectile function, which is produced via the activation of the endothelial nitric oxide synthase (eNOS) operated by the upstream PI3K/Akt signal pathway in the endothelial cells. As one of the main active constituents of Cistanche, it has been reported that echinacoside (ECH) increased NO production by eNOS phosphorylation. Therefore, in order to clarify the activation effects of ECH on PI3K/Akt pathway, we investigated the phosphorylation of two upstream kinases using the eNOS kinase inhibitor and PI3K kinase inhibitor under the treatment of ECH in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Also, starved HUVECs will be treated with ECH for indicated times or with various concentrations for the investigation of the time-effect or the dose-effect relationship between ECH and the eNOS (or Akt) phosphorylation using Western-blot analysis. Further, to investigate whether AR was involved in the ECH-induced activation of PI3K/Akt/eNOS pathway specially, the NO production induced by ECH will be examined under the treatment of AR antagonist or using siRNA to knock down gene expression of AR. The research will help to understand the mechanism that involvement of AR in NO production induced by ECH in endothelial cells through PI3K/Akt/eNOS pathway to prevent the erectile dysfunction, which will be beneficial to the development of Cistanche resource.

肉苁蓉增强阴茎勃起功能与其植物雄激素作用相关,主要通过雄激素受体(AR)介导,但确切机制尚不清楚。一氧化氮(NO)是维持勃起的重要因子,PI3K/Akt是激活内皮细胞eNOS生成NO的重要上游信号通路,肉苁蓉主要活性成分松果菊苷(ECH)可通过磷酸化eNOS诱导NO释放。因此,本项目采用eNOS及PI3K激酶抑制剂探讨ECH对NO生成过程上游激酶的影响,运用Western-blot技术确定ECH与Akt、eNOS蛋白磷酸化水平的时效和量效关系,从而阐明ECH对PI3K/Akt通路的激活作用;观察AR拮抗剂预处理或通过siRNA技术降低AR表达水平对ECH诱导NO生成过程的影响,揭示AR在ECH激活该通路中的特异性介导作用。该项目的完成将阐明ECH通过AR特异性介导作用激活PI3K/Akt/eNOS通路诱导血管内皮细胞释放NO增强勃起功能的机制,对肉苁蓉资源的开发和应用具有意义。

项目摘要

肉苁蓉是列当科肉苁蓉属(Cistanche)多年生草本植物,具有补肾益精、润肠通便作用,被誉为“沙漠人参”。研究显示肉苁蓉具有植物雄激素作用,其活性成分松果菊苷(Echinacoside,ECH)可诱导内皮细胞释放一氧化氮(NO)促进平滑肌舒张。为了进一步探究ECH发挥植物雄激素作用诱导NO在内皮细胞生成的上游信号机制,本项目选用人脐静脉血内皮细胞(HUVECs)作为体外模型,基于PI3K/Akt 信号通路,探究雄激素受体(AR)介导ECH激活一氧化氮合酶(eNOS)磷酸化促进内皮细胞生成NO的分子机制。通过荧光分光光度法及Western-blotting 技术,观察ECH处理后HUVECs生成NO及eNOS蛋白磷酸化的变化。结果显示在10 μmol/LECH处理下,内皮细胞NO生成量明显增加;当预先加入0.5 mmol/L eNOS抑制剂,ECH对NO生成的促进作用被阻断。通过观察ECH对HUVECs细胞eNOS及Akt蛋白磷酸化的时效关系和量效关系,验证PI3K/Akt通路是ECH促进内皮细胞NO生成的细胞内信号通路。运用特异性PI3K 抑制剂比较细胞培养基中NO 生成量及内皮细胞eNOS、Akt 磷酸化水平差异,结果发现采用PI3K抑制剂wortmannin预处理内皮细胞,ECH对内皮细胞生成NO及eNOS磷酸化的促进作用均降低,提示ECH是通过活化PI3K使Akt磷酸化,从而激活下游eNOS 磷酸化进而诱导内皮细胞产生NO。通过受体拮抗剂的应用与siRNA 基因沉默技术作为平行观察手段,以ER 为对照,观察AR 在ECH 激活PI3K/Akt/eNOS 通路中是否具有特异性介导作用。结果显示内皮细胞给予雄激素受体(AR)拮抗剂nilutamide预处理,ECH对内皮细胞激活eNOS磷酸化生成NO的促进作用被废除,而雌激素受体(ER)拮抗剂ICI182789没有显示相似的作用。而内皮细胞转染AR-siRNA后,ECH对内皮细胞激活eNOS磷酸化生成NO的促进作用被废除。以上结果提示AR特异性地介导了ECH激活内皮细胞eNOS磷酸化促进NO生成的过程。本项目从信号通路和受体介导两个角度阐释肉苁蓉的主要活性成分松果菊苷发挥植物雄激素作用诱导血管内皮细胞生成NO的分子机制,对肉苁蓉这一传统补肾中药在现代药品及功能食品领域的开发及应用具有重要作用。

项目成果
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数据更新时间:2023-05-31

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