利用超远缘遗传转化酵母技术解析龙胆苦苷生物合成关键酶基因

构建高产龙胆苦苷的酵母工程菌是解决当前国内外天然药物龙胆苦苷来源短缺、高效解析其生物合成关键酶基因及其代谢机制的有效途径之一。本项目针对当前龙胆苦苷主要药源植物资源短缺及龙胆苦苷生物合成关键酶基因未知的问题，基于目前酵母基因组可与植物基因组的部分DNA片段进行超远缘杂交而能生产药用有效成分的理论研究基础，利用低能离子注入介导的超远缘遗传转化技术，建立多形汉逊酵母与药用植物秦艽DNA杂交技术平台；利用自行设计的高通量原位筛选方法，获得分泌表达龙胆苦苷的无筛选标记的重组酵母工程菌；以所得酵母工程菌为研究对象，借助酵母遗传操作系统，运用功能基因组学、代谢组学等手段，克隆龙胆苦苷生物合成关键酶基因，并阐明其功能与调控机制。本项目通过将新的研究手段和思路运用于阐明龙胆苦苷生物合成关键酶基因功能及其调控机制，将为拓展药用植物功能基因的研究方法、保护我国龙胆科药用植物资源提供理论基础和实践依据。

天然药物龙胆苦苷多来源于龙胆科多年生草本植物秦艽。秦艽适生地窄，栽培困难，生长周期长，已被列入国家三级保护野生药材。由于其使用范围不断扩大，市场需求量逐年增加，致使野生资源急剧下降，供需矛盾非常突出。因此，研究和开发秦艽新资源、解决龙胆苦苷来源短缺问题亟需寻求其他药源途径和新的研究方法。龙胆苦苷生物合成受多基因代谢调控，目前关于龙胆苦苷生物合成基因的信息鲜有报道。.本项目利用酵母平台，以解析龙胆苦苷生物合成关键酶基因功能研究为主线，系统探索了低能离子注入介导的超远缘遗传转化多形汉逊酵母的技术体系，优化了能有效解析基因功能的多形汉逊酵母遗传操作系统，明确了低能离子注入介导的超远缘遗传转化多形汉逊酵母的最佳转化条件；建立了基于低能离子注入介导的超远缘遗传转化酵母的高通量筛选方法；利用低能离子注入介导的合成生物学技术方法获得了3株能生物合成龙胆苦苷的酵母重组菌株；进而以产龙胆苦苷重组酵母工程菌为研究对象，利用酵母重测序、基因表达/敲除、代谢组学等方法解析了龙胆苦苷生物合成2个关键酶基因功能。.在国内外重要学术期刊上发表论文9篇（其中SCI收录2篇，EI期刊收录1篇）；申请国家发明专利7项，已获授权3项；培养硕士研究生3名；参加国内学术会议3次。.通过本项目研究，为全面解析龙胆苦苷生物合成途径研究提供了新材料和新方法，也为定向构建高效合成龙胆苦苷的重组酵母菌提供了理论依据。