羊传染性脓疱病毒感染后宿主细胞差异表达基因的筛选与鉴定

病毒与宿主相互作用构成病毒感染、致病及免疫的分子基础，病毒感染后可通过多种信号转导途径引起病毒和宿主细胞一些基因表达水平的变化，然而这些差异表达基因是否参与病毒的感染和致病过程仍需要进行系统深入的研究。为了筛选羊传染性脓疱病毒（ORFV）感染状态下宿主细胞的差异表达基因并明确其在ORFV感染和致病过程中的作用，本项目拟从病毒与宿主相互作用的角度入手，应用抑制消减杂交技术（SSH）建立ORFV感染MDBK细胞特异性cDNA消减文库；通过菌落PCR、斑点杂交等方法筛选感染宿主细胞中的差异基因，并对其进行序列测定、生物信息学分析以获得相关的信息；构建目标差异基因RNAi载体及过量表达载体，分别转染细胞验证该差异基因在ORFV感染过程中的作用。该项研究不仅有助于阐明ORFV感染的分子机制，而且将为进一步筛选抗病毒药物新靶点奠定基础，从而为羊传染性脓疱病诊断与防治的研究提供新思路。

病毒感染涉及到病原与宿主两方面的相互作用，病毒感染后能与宿主细胞多种组分发生作用而引起宿主细胞内一些基因的差异表达及其所介导信号通路的改变，造成细胞生理功能异常从而导致疾病的发生。因此，仅从病原角度很难阐明其对宿主的感染机制。鉴于此，本研究从病毒与宿主互作角度入手，针对病毒早期感染阶段，采用抑制性消减杂交技术构建了ORFV早期感染宿主细胞特异性cDNA消减文库。经质粒PCR、反向斑点杂交筛选及序列测定等方法对文库中差异基因进行筛选鉴定，共获得差异表达基因81条，其中正向文库60条，反向文库21条。应用http://panther.appliedbiosystems.com生物学软件对差异基因进行功能预测，结果显示，所获得差异基因所具有分子功能主要为具有结构活性、结合功能、转录调节活性、转运功能、翻译调节活性、酶调节活性、催化活性等；其参与的生物学过程包括有代谢过程、运输过程、定位过程、免疫过程、细胞周期、发育过程、刺激反应过程、凋亡过程等。根据以上生物信息学预测结果，寻找在ORFV早期感染过程中起关键作用的差异基因成为全面阐述ORFV致病分子机制的突破点。通过分析发现，正向文库中F-21丝裂原活化蛋白激酶6（MKK6）、F-50亲环蛋白B（CyPB）以及反向文库中的R-1丝裂原活化蛋白激酶4（MKK4）、R-14热休克蛋白70（HSP70）、R-4 S100钙结合蛋白A4等一些重要的差异表达蛋白；例如，F-21丝裂原活化蛋白激酶6（MKK6）及R-1丝裂原活化蛋白激酶4（MKK4）等被证实分别能够激活p38MAPK信号通路和JNK信号通路等细胞内重要的信号转导通路，这些信号通路被证实与细胞凋亡相关；热休克蛋白参与多种DNA病毒的感染复制过程。由于文库信息量很大，我们主要是侧重于上述与免疫、凋亡、酶活性相关等差异基因的研究，首先对正向文库中显著上调表达的宿主细胞蛋白CyPB（F-50）进行研究，利用过表达及RNAi等方法证实CypB能够促进ORFV的早期增殖复制，但其是通过与病毒蛋白的直接作用还是与宿主细胞其他蛋白相互作用而对侵染过程进行调控，尚有待于进一步探讨。就整个文库而言，我们也将进一步针对筛选获得的与免疫、凋亡等有关差异基因开展相关研究。该项研究不仅有助于阐述ORFV致病机制，而且将为进一步筛选抗病毒药物新靶点奠定基础，为羊传染性脓疱病的防治研究提供新思路。