GDNF及其受体RET在胰腺癌神经侵袭中的作用机制及阻断治疗研究

神经侵袭在胰腺癌中发生率较高，是导致胰腺癌患者剧烈疼痛、手术后复发和预后不良的重要因素。本项目在前期研究发现胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）及其受体RET对于MIA PaCa-2和Capan－2胰腺癌细胞具有化学趋化作用、促增殖作用且呈剂量依赖关系的基础上，通过能够模拟胰腺癌细胞沿神经轴突浸润动态过程的体外实验模型- - 背根神经节细胞（DRG）与胰腺癌细胞系共同培养和坐骨神经侵袭裸鼠动物模型以及胰腺癌原位移植腹膜后神经侵袭裸鼠动物模型，进一步研究胰腺癌细胞与神经之间的动态相互作用、GDNF及其受体RET所起的作用、可能的机制以及进行阻断治疗实验的效果。研究结果能进一步明确胰腺癌神经侵袭的动态过程、GDNF及其受体RET所起的作用及机制、GDNF及其受体成为药物靶向治疗神经侵袭的靶点的可能性，从而可以为针对胰腺癌神经侵袭相关因子及受体的靶向治疗提供理论依据。

目的：(1) 构建人胰腺癌细胞系MIA Paca-2/DRGs的共培养模型，为胰腺癌神经侵袭的研究提供新的可量化的体外模型。(2) 观察胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）在胰腺癌细胞神经侵袭中的作用及阻断效果，探讨其诱导神经侵袭的可能的作用机制。.方法：(1) 培养人胰腺癌细胞系MIA Paca-2细胞并通过RT-PCR方法检测RET基因的表达，制备大鼠背根神经节（DRGs）并通过RT-PCR方法检测GDNF基因的表达。(2) MTT方法分别检测促分裂原活化蛋白激酶通道（MAPK）阻断剂PD98059和磷脂酰肌醇3激酶通道（PI3K）阻断剂LY294002在不同浓度、不同作用时间条件下对胰腺癌细胞MIA Paca-2存活率的影响，利用Trans-well装置在boyden小室的下室中分别加入不同的细胞因子通过计数各组跨膜细胞的数量并进行统计学分析，检测GDNF对胰腺癌细胞的趋化作用和PD98059、LY294002的阻断效果。（3）：人Mia PaCa-2 和Capan-2胰腺癌细胞株培养，运用大体标本观察和病理切片HE染色的方法观察模型中肿瘤大小、转移情况和胰腺癌神经侵袭的情况。.结果：(1) RT-PCR方法检测MIA Paca-2与DRGs中分别有RET及GDNF基因的表达。在MIA Paca-2/DRGs共培养体系中，胰腺癌细胞与神经突出现互相吸引的趋化性生长。(2) MTT实验中，培养基中分别加入不同浓度的PD98058或LY294002后，在不同作用时间下胰腺癌细胞形态未发生明显改变，各组的细胞存活率并没有显著差异。（3）裸鼠胰腺原位植瘤术后成瘤率100%，腹膜后神经侵犯组与其他组比较差异均有统计学意义（P<0.01）。.结论：(1) 成功构建了人胰腺癌细胞系MIA Paca-2/DRGs的共培养模型，为胰腺癌神经侵袭的进一步研究提供了直观的可量化的体外模型。(2) GDNF可增强胰腺癌细胞MIA Paca-2的侵袭转移能力，发挥这一作用的途径可能与促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）通道和磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）通道有关。（3）：神经侵袭是胰腺癌发展过程中的一个早期、独立的事件。