红鳍东方鲀诱导性多能干细胞(iPS cell)的生成及发育分化研究

iPS 技术是一种实现体细胞核重编程为类胚胎干细胞的新兴技术。为建立一套应用于细胞系的安全而便捷的iPS细胞生成体系，本研究以业已建立的红鳍东方鲀精巢细胞系为初步研究对象，克隆Oct4和Sox2两个基因，中间以自剪切多肽E2A连接，重组到非整合型质粒载体pcDNA3.1上，脂质体包埋转染细胞，筛选并纯化出iPS细胞，并对其进行外源基因导入的初步研究，获得基因组中稳定整合有GFP基因的iPS细胞，进而将GFP-iPS细胞显微注射入红鳍东方鲀囊胚期胚胎的囊胚腔中，构建出胚胎嵌合体，追踪其发育分化轨迹。研究结果将为通过外源基因导入、基因敲除和基因改造等遗传修饰操作进行鱼类新品种的培育奠定基础。

自2006年Takahashi利用Oct4和Sox2等四个因子成功获得小鼠诱导性多能干细胞以来，已先后获得了人、牛、猪、猴等多物种的iPS细胞，诱导方法从最初的逆转录病毒导入法进展到利用体外转录mRNA、重组蛋白、miRNA甚至仅添加小分子诱导物等。本项目在借鉴哺乳动物iPS细胞诱导的基础上，对水产动物红鳍东方鲀iPS细胞的诱导进行了三种诱导方案的探索，一是构建转录因子真核表达载体转染细胞进行诱导；二是利用原核表达的转录因子重组蛋白进行诱导；三是利用miRNA调控相关基因表达进行诱导。进展如下：通过转染方法的优化，红鳍东方鲀精巢细胞系的真核表达载体的转染效率提高到了50%以上；原核表达的重组蛋白Oct4-11R-His及Sox2-11R-His在穿膜肽的介导下可成功导入鱼细胞，效率超过80%，且通过报告基因检测，可以发挥转录因子活性；筛选到与iPS诱导相关的miRNA429、miRNA200a、miRNA200b，转入细胞后，进行了调控基因的表达研究。目前三种诱导方案均进行了最大优化，鉴于iPS细胞诱导的低效率，大批量的筛选工作仍在进行中。