杂草抗药突变型ALS与其抑制剂相互作用的分子机理

近几年,稻田抗乙酰乳酸合成酶(ALS)抑制剂的突变型杂草仍处于高危态势。对此，在水稻生长中期不得不再次处理非ALS靶标的老式除草剂，带来诸多问题，危及水稻安全、高效生产。本项目在前期完成慈姑、雨久花抗药性突变机理基础上，以ALS抗药多态性丰富的雨久花为试材，采用同源建模、分子对接模拟技术，分析靶标酶、辅酶、底物与除草剂络合结构的结合方式及其分子引力，探明感、抗靶标酶体系与除草剂的结合方式和相互作用分子机理，揭示不同抗药突变型ALS结构与不同种类ALS抑制剂之间的亲和性变异机制以及不同抗药突变型ALS对靶标除草剂产生不同感、抗效应的现象，为合理选用反抗型ALS靶标除草剂种类和研发新型反抗类除草剂分子结构，提供新的理论依据和方法。

1、构建了感性（野生型）ALS和第197位脯氨酸被苏氨酸、丙氨酸、丝氨酸分别替代突变的三种抗药突变型ALS构象的晶格结构；构建了野生型和抗药突变型ALS活性部位氨基酸残基与除草剂（氯嘧黄隆）、辅酶分子对接构型的晶格结构。.2、利用所构建的四种异构ALS的活性位氨基酸残基与除草剂、辅酶分子对接构型的晶格结构，测定了氯嘧黄隆（CIE）与其靶标ALS对接构型的稳定性特征。结果显示在野生型ALS中，CIE的构象平方根偏差（RMSD）和旋转半径（Rg）值和变异幅度小，在2维图中表现单一高斯峰，处于稳定状态；而抗药突变态中则相反，RMSD和Rg值大、双峰状态，处于不稳定状态。依据抗药突变型中CIE构象分布的双峰现象，推测抗药突变型植物细胞内ALS处于不稳定的二聚体状态。.3、通过测量活性部位通道入口处氨基酸残基位之间的分隔距离，结果揭示活性部位入口大小不是固定不变，而是具有扩缩变化；与197位脯氨酸的野生型活性通道入口相比，197位苏氨酸替代突变的入口变小，丙氨酸和丝氨酸突变的入口变大。推测“入口堵塞”型抗药突变分子机理依据不充分。通过RMSD变异分布和氨基酸残基分布距离测定，论证了多相的ALS构象实体存在。ALS构象是可扭动的，某一位点的变化诱导相邻部位氨基酸构象的变化。.4、在除草剂与感、抗性ALS对接系统中，除草剂构象的平方根偏差和旋转半径值的分布特征差异，筛选了对197 脯氨酸抗药突变型ALS高亲和力的5个黄酰脲类基本骨架的新结构。目前还没合成实物。拟化学合成新结构的磺酰脲类化合物，并鉴定、评价其抑制靶标酶活性和选择性特征。.5、对吉林省主稻区5万公顷稻田进行了抗药性杂草普查。结果，约23%稻田发生抗药生态型慈姑、雨久花、稻稗以及耐药性稻李氏禾、杂草稻等；针对抗黄酰脲类除草剂突变型检测结果，慈姑、雨久花的抗性突变型为ALS靶标氨基酸替代诱导型，测定了抗药突变型慈姑ALS基因的全序列，找到突变位，并已登记在NCBI；检测了吉林省主稻区发生的抗药突变型杂草的抗性特征，提出了有效防除稻田抗药性杂草技术措施。