普通小麦TaMBD6基因的A、B、D同源序列克隆及其在种子发育过程中的功能分析

小麦种子发育过程是产量和品质形成的关键时期，探讨种子发育的分子调控机理对于开展小麦高产优质分子育种具有重要意义。课题组在前期研究中，发现小麦甲基结合蛋白TaMBD6与种子的发育调控密切相关。本研究拟克隆TaMBD6基因在小麦A、B、D染色体组中的3个部分同源基因，并比较分析它们的序列特征；利用实时定量RT-PCR分析在种子发育过程中3个部分同源基因的时空表达模式；通过亲和色谱结合蛋白质双向电泳（2-DE）技术筛选小麦种子中与TaMBD6互作的靶蛋白，通过质谱分析对靶蛋白进行鉴定；筛选1-2个重点侯选蛋白，通过酵母双杂交系统进一步验证候选蛋白与TaMBD6的互作特性。依据上述研究结果综合分析TaMBD6在小麦种子发育过程中的生物学功能，为探讨小麦种子发育的调控机制提供新的研究思路。

种子发育过程是小麦产量和品质形成的关键时期，探讨种子发育进程的分子调控机制对于开展小麦高产优质分子育种具有重要意义。在植物发育调控过程中，依赖于DNA甲基化的基因表达调控发挥重要作用，而甲基结合蛋白MBD是参与这一调控过程的重要因子。本项目以普通小麦为材料，克隆了甲基结合蛋白TaMBD6 的三个部分同源基因，比较了它们的序列特征，分析了其在种子发育过程中的时空表达模式，并开展了互作蛋白筛选和转基因功能研究。主要结果包括：1）TaMBD6的三个部分同源基因的cDNA在编码区序列差异较小，而在5＇和3＇UTR区域的差异较大；3个部分同源基因均包含2个内含子，其中一个内含子约3 kb，位于起始密码子下游约78bp 的位置，推测该内含子可能参与了该基因的表达调控；染色体定位显示，TaMBD6的三个部分同源基因定位在第五同源染色体群上，分别命名为TaMBD6-5A，TaMBD6-5B和TaMBD6-5D。2）对TaMBD6的3个部分同源基因启动子区域的克隆和分析显示，这3个基因的启动序列在从-1到-360bp区域基本相同；但是在-360bp上游区域，这三个基因间序列差异很大；进一步分析发现，3个启动子的TATA box 均在-21位置，且包含G-box和 Sp1等多个光调控元件，ABA、MeJA和auxin多个激素响应元件，另外还包含Skn-1_motif和GCN4_motif等与胚乳基因表达相关的调控元件，推测TaMBD6 在种子（胚乳）发育调控过程中发挥着重要的功能。3）基因表达特性分析显示，TaMBD6-5D和TaMBD6-5B在不同发育时期小麦种子种中的表达水平差别不大，而等位基因TaMBD6-5A在授粉后25天时显著上调表达，推测其在籽粒灌浆过程中发挥功能。4）构建了酵母诱饵表达载体PGBKT7-TaMBD6-5A，利用酵母双杂交系统筛选了TaMBD6-5A 的互作候选蛋白，确定了NDPK和ENTH结构域蛋白为其重点候选互作蛋白。5）构建了种子特异启动子Gli驱动的TaMBD6-5A的RNAi抑制表达载体，并获得21株初步鉴定的转基因小麦植株。上述研究结果，为进一步探讨TaMBD6在小麦种子发育过程中的生物学功能积累了重要资料。