2B4在孕期弓形虫感染致不良妊娠结局发生中的作用机制研究

The greatest damage of Toxoplasma gondii (T. gondii ) infection is to result in adverse pregnancy outcomes such as miscarriage, stillbirth and so on. However, its important mechanisms are still to be further investigated. Our previous studies have found that the functional abnormality of decidual NK cells (dNK) following T. gondii infection was closely associated with adverse pregnancy outcomes. 2B4, mainly expressed on dNK cells at the fetal-maternal interface, could inhibit the cytotoxicity of dNK cells which is good for maintaining normal pregnancy. Our previous study showed that, compared with wild type infected pregnant mice, 2B4 knockout infected pregnant mice had more obvious adverse pregnancy outcomes; 2B4 expression was obviously down-regulated on dNK cells following T. gondii infection. It is unclear that whether T. gondii infection could affect the expression of 2B4 leading to abnormal dNK function, and then participate in abnormal pregnancy outcomes induced by T. gondii infection. .Based on our previous studies, an infection culture system of human dNK cells were established in vitro, while 2B4 knockout T. gondii infected pregnant mice model was established in vivo to declare the role of 2B4 in adverse pregnancy outcomes caused by T. gondii infection, and provide scientific evidence for discovering an effective molecular target for preventing and treating congenital toxoplasmosis.

孕期弓形虫感染最大危害是导致流产、死胎等不良妊娠结局的发生，但其分子机制有待于进一步阐明。本室研究发现，蜕膜NK细胞功能异常与弓形虫感染致不良妊娠结局发生密切相关。2B4是表达在蜕膜NK细胞上的主要免疫抑制分子，通过抑制蜕膜NK细胞杀伤活性，有利于维持母胎耐受，其表达异常可导致流产等不良妊娠结局的发生。本室前期研究发现，弓形虫感染造成2B4敲除孕鼠较野生型孕鼠更严重的不良妊娠结局，且弓形虫感染后蜕膜NK细胞2B4表达明显下降，那么，弓形虫感染是否通过影响2B4的表达，进而导致蜕膜NK细胞杀伤功能异常，从而参与弓形虫感染致不良妊娠结局发生的呢？亟待进一步探索。本项目拟在前期研究基础上，通过体外建立人蜕膜NK细胞感染体系，体内建立2B4敲除弓形虫感染孕鼠模型，探索2B4在孕期弓形虫感染致不良妊娠结局中的作用机制，为发现有效预防和阻断先天性弓形虫病的分子靶点提供科学依据。

弓形虫感染可引起宫内流产、胎儿死亡等不良妊娠结局的发生。2B4，在不同的细胞种类及不同状态下，发挥的功能也不同。已有研究证实，在母胎界面，2B4主要表达在蜕膜NK（dNK）细胞，是抑制dNK细胞杀伤活性的关键分子。本室研究发现，弓形虫感染可导致小鼠及人dNK细胞2B4的表达降低，且较弓形虫感染的野生孕鼠，2B4基因敲除（2B4-/-）感染的孕鼠不良妊娠结局更重。然而，2B4在孕期弓形虫感染致不良妊娠结局发生中的详细分子机制及信号通路尚不清楚，有待于深入探索。. 本项目建立2B4-/-感染孕鼠模型，体外建立抗2B4抗体交联的人dNK细胞培养体系，深入阐明2B4在孕期弓形虫感染致不良妊娠结局发生中的作用机制；本项目还研究了TGF-β1对dNK细胞的影响在改善弓形虫感染致不良妊娠结局中的分子机制。.主要获得以下结果：.（1）弓形虫感染可导致蜕膜CD45+细胞，dNK细胞耐受和活化亚群表面及胞内2B4的表达均降低，且由于2B4配体CD48也发生明显降低趋势，导致2B4的磷酸化水平降低，引起下游SAP， SHP-1/2的表达异常，最终导致dNK细胞杀伤活性增加，而导致妊娠失败。.（2）弓形虫感染可导致dNK细胞内Granzymes B、TNF-α、IFN-γ的表达升高， TGF-β1的表达下调，在弓形虫感染的情况下，2B4 交联可下调Granzymes B、TNF-α及IFN-γ的表达，上调TGF-β1的表达，且较感染的野生孕鼠，2B4-/-感染的孕鼠dNK细胞内颗粒酶B表达降低、TNF-α及IFN-γ的表达水平明显升高，表明在弓形虫感染的情况下，2B4能够调节dNK细胞的功能，进而破坏母胎耐受微环境，最终导致妊娠结局的失败。.（3）重点对在弓形虫感染的情况下，2B4如何导致TNF-α及IFN-γ的改变进行了深入的探索，发现，2B4主要通过调节SAP-Fyn-p-ERK通路影响dNK细胞内TNF-α及IFN-γ的表达，而2B4也可通过SHP-1/2RAS--p-P38通路影响TNF-α及IFN-γ的表达。.（4）TGF-β1治疗能抑制dNK细胞NKG2D-DAP10的表达水平，进而下调dNK细胞杀伤活性，在改善弓形虫所致的不良妊娠结局中发挥重要作用。.以上研究结果证实，2B4在孕期弓形虫感染所致不良妊娠结局的发生中发挥重要作用，有望成为治疗弓形虫病的有效靶点。