基于原子力显微镜定量分析单个凝血蛋白在生物膜表面的取向与功能

Coagulation protein factor VIII (FVIII), one of key peripheral membrane proteins in blood coagulation, is associated with thrombus and cardiovascular disease. Our previous experimental results have shown that the activity of FVIII is influenced by site-directed mutagenesis of the amino acids on the membrane-interactive surface as well as the antibodies against these interfaces, and also regulated by the lipid membrane, indicating the full activity of FVIII may be related to its right orientation on a membrane surface. However, current available techniques for protein orientation on solid surfaces are not suitable for these kind of membrane-bound proteins because of the dynamic nature of lipid bilayers and can merely provide the ensemble averaging information based on bulk measurements. This proposal aims at developing an atomic force microscopy（AFM）-based technique to quantitatively determine the orientation of proteins on a membrane surface through the height measurement of single protein molecules. Combined with nanomechanical imaging and non-contact high-resolution imaging techniques of AFM constructed recently in our group, this developing method will be used to explore the orientation of FVIII on the membrane surface by investigating the role of the amino acids in and antibodies against its membrane-interactive domains. The effect of the physical properties of cell membranes, such as phase separation, surface charge, and membrane curvature, on the protein orientation will be also investigated. These results obtained would not only provide experimental methodology and direct evidence on the binding and orientation of membrane-bound proteins, such as FVIII, but also be of great interest in revealing the regulation relationship of the protein function within or upon a membrane surface.

凝血蛋白八因子(FVIII)是处于凝血反应中心位置的一种外周膜蛋白，其功能与血栓和心血管疾病密切相关。我们前期研究发现与生物膜结合的氨基酸以及结合其膜界面结构域的抗体、膜物理化学性质都可明显调控FVIII的活性，提示FVIII的功能很可能与其在膜上的取向有关。常规研究蛋白取向的技术很难用于膜结合蛋白，并且多是群体水平测量，更不能动态研究膜物理性质与蛋白质功能之间的关系。本项目旨在发展基于原子力显微镜(AFM)对膜表面的单个蛋白质分子高度精确测量的技术，直接观察和定量分析FVIII在膜表面的取向，然后结合课题组最近建立的AFM纳米力学成像和非接触高分辨成像新技术，研究生物膜的相变、电荷和曲率等物化性质以及蛋白质的膜结合界面及其抗体对取向的影响，从而在单分子水平上为研究FVIII等外周膜蛋白在膜表面的结合与取向提供试验方法和证据支持，为揭示生物膜的物理性质对膜蛋白功能调控的机制奠定基础。

凝血蛋白八因子(FVIII)是处于凝血反应中心位置的一种外周膜蛋白，其功能与血栓和心血管疾病密切相关。前期研究发现与生物膜结合的氨基酸以及结合其膜界面结构域的抗体、膜物理化学性质都可明显调控FVIII的活性，提示FVIII的功能很可能与其在膜上的取向有关。常规研究蛋白取向的技术很难用于膜结合蛋白，并且多是群体水平测量，更不能动态研究膜物理性质与蛋白质功能之间的关系。本项目的主要研究内容包括发展可对单个蛋白质分子高度精确测量的原子力显微镜(AFM)技术，在此基础上研究生物膜的相变、亲疏水性等对蛋白取向的影响。我们基于AFM纳米力学成像技术，成功发展了可对单个蛋白质的高度和力学性质进行精确测量的方法，申请了一项国家发明专利；利用该技术，测量了钙离子存在下凝血蛋白的结构和力学性质，发现凝血蛋白的力学性质的变化依赖于钙离子的浓度；研究了亲疏水界面对蛋白质高度的影响，揭示了界面的疏水性质和蛋白的疏水结构域通过疏水相互作用共同决定了其优先取向；研究了钙离子可以导致含负电荷磷脂分子的生物膜发生相分离，相分离所产生的负电荷结构域是凝血蛋白FVIII结合的位点，为钙介导的膜与促凝血蛋白的相互作用提供了直接证据；通过人工定点突变蛋白质的不同氨基酸位点，分析蛋白质嵌入生物膜的深度、自由能和倾斜角之间的关系，明确了凝血蛋白C1和C2结构域协同作用决定了蛋白在膜内的取向。本项目的完成不仅在单分子水平上为研究FVIII等外周膜蛋白在膜表面的结合与取向提供试验方法和证据支持，为进一步研究其结构和功能关系奠定了基础。同时，单个蛋白质分子在膜表面取向与功能关系研究体系的建立和发展对于揭示生物膜的物理性质对膜蛋白的功能调控机制具有重要的意义，而且所建立的定量力学测量方法同样适用于对细胞的力学表型定量，显示了良好的普适性和广泛应用前景。