m6A RNA去甲基化酶对T细胞功能调控的研究

m6A RNA modification is the most common and abundant messenger RNA modification, modulated by “writers”, ”erasers” and “readers” of this mark. It has been shown that m6A influences all fundamental aspects of mRNA metabolism, mainly mRNA stability, to determine cell differentiation, proliferation and respond to stimulations. We previously found that the deletion of m6A ‘writer’ protein METTL3 in mouse T cells disrupts Naive CD4 T cell homeostasis and differentiation, and also affect the function of Regulatory T cell (Tregs); knockout of METTL3 within Tregs results in auto-immune disease in adult mice. However, the function of m6A demethylases in T cells still unknown. Our previous data showed that knockout of m6A demethylatse ALKBH5 alleviates EAE induce by MOG in mice. Therefore, we hypothesis that m6A demethylases play a vital role in regulating the function of T cells. In this project, we will study the following scientific questions: 1. How does m6A demethylases regulate the function of T cells; 2. And it’s underlying mechanism. Based on the understanding of the molecular mechanism on how m6A demethylases regulating the function of T cells, we will get better understanding of the role of m6A in immune system, and the possibility and strategy to manipulate T cells functions by targeting m6A demethylases.

m6A RNA甲基化修饰是mRNA上分布最广泛的化学修饰，研究发现m6A参与mRNA代谢的各个过程，对细胞分化、增殖以及应对外界刺激起着极其重要的调控作用。我们已发表的研究结果发现，m6A甲基化酶可以通过催化m6A的形成，调控幼稚T细胞(Naive T)稳态、分化及Treg细胞的功能。然而，m6A去甲基化酶在T细胞中的作用仍未可知。我们的前期研究发现，T细胞内特异性敲除m6A去甲基化酶ALKBH5可显著缓解小鼠实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)。因此，我们提出m6A RNA去甲基化酶对T细胞功能具有重要的调控作用。本课题拟研究如下科学问题：1.m6A RNA去甲基化酶如何参与调控T细胞功能；2.其具体的分子机制是什么。对上述问题的回答，将使我们进一步认识与理解m6A修饰动态变化调控免疫系统的机制，为开展以m6A RNA去甲基化酶为潜在靶点，干预及调控T细胞功能提供理论依据。

RNA结合蛋白是基因表达的关键效应因子，调控包括RNA的转录、剪接、修饰、细胞内运输、翻译和降解等多个方面，对维持细胞稳态和应激反应十分重要。巨噬细胞是最重要的固有免疫细胞之一，直接参与机体的抗感染和肿瘤免疫过程。然而，巨噬细胞活化的RNA代谢调控过程仍不清楚。.为了深入研究RNA代谢对巨噬细胞的调控作用，我们首先利用CRISPR-Cas9技术，对参与调控巨噬细胞活化过程的关键RNA结合蛋白进行高通量筛选，发现m6A甲基化酶复合物中的关键基因（METTL3、METTL14、NUDT21和RBM15）显著富集在TNF-Low的细胞群中，提示m6A是对巨噬细胞活化十分重要。进一步，我们发现在单核/巨噬细胞细胞系Raw264.7及原代巨噬细胞中敲除METTL3均可显著抑制LPS诱导的巨噬细胞活化及后续炎症因子的产生。鉴于巨噬细胞在抗感染和抗肿瘤中的重要作用，我们又对METTL3在体内巨噬细胞中的功能进行了进一步的研究，发现巨噬细胞特异性敲除METTL3的小鼠对沙门氏菌更加易感，抗肿瘤能力下降；敲除METTL3的肿瘤浸润巨噬细胞高表达M2型巨噬细胞相关marker，而M1型巨噬细胞相关marker显著下调，相应的肿瘤浸润T淋巴细胞高表达免疫抑制性受体PD-1。上述结果表明METTL3可通过调控巨噬细胞的活化促进其抗感染和抗肿瘤功能。进一步的研究发现，敲除METTL3可导致TLR信号通路的负调控应激因子IRAKM显著上调，而对其他关键的接头蛋白的表达水平没有显著影响，而在METTL3缺陷的巨噬细胞中敲低IRAKM可恢复巨噬细胞炎症因子的表达。我们利用MeRIP-seq发现，Irakm mRNA的3UTR上有显著的m6A峰，敲除METTL3后该m6A峰消失，证明Irakm是m6A的靶基因。RNA降解实验和荧光素酶报告基因实验表明，m6A主要通过影响Irakm mRNA的降解，调控TLR信号诱导的巨噬细胞活化。综上，我们的研究发现了m6A甲基化酶METTL3靶向并降解早期应激反应分子Irakm的mRNA，调控巨噬细胞活化进而影响其抗感染和肿瘤杀伤能力。为治疗反复感染和肿瘤提供了新的靶点和思路。