补肾中药对抗衰老基因klotho表达的调控和干预机制研究

衰老是老年病的"百病之源"，延缓病理性衰老、治疗伴随衰老而来的疾病是人类长期以来的课题。补肾是中医治疗衰老的重要治法，抗衰老基因klotho缺失后表现出与人类肾虚致衰相似的表型。本研究拟观察衰老及慢性盐负荷的自发性高血压大鼠与"肾"相关脏器、大鼠肾小管上皮细胞经AngⅡ和盐高渗处理后Klotho表达水平的变化，并利用作用明确的补肾药物（淫羊藿总黄酮、淫羊藿苷；何首乌二苯乙烯苷类提取物、何首乌二苯乙烯苷）从调节长寿基因klotho及相关信号通路入手，运用多种技术手段观察衰老过程中整体、细胞模型多个指标的改变。本项目的顺利实施可促进我们从新的角度了解"肾藏精"脏象理论的物质基础，增加对长寿基因Klotho抗衰老作用的认识，揭示补肾药物调节抗衰老基因的主要作用点和作用环节，促进相关药物的开发和评价。

长寿基因klotho缺失后表现出与中医肾虚致衰相似的表型，本研究从klotho的特征、功能入手，应用荧光素酶报告基因、荧光实时定量PCR、免疫组化、蛋白芯片等多种实验技术，以细胞衰老模型和自发性高血压大鼠为研究对象，对klotho与中医“肾藏精”脏象理论的相似之处进行了比较。.结果显示：1）在转染klotho基因报告系统的HEK293/klotho-luc细胞上，补肾药物的活性成分淫羊藿苷和何首乌二苯乙烯苷能有效促进klotho的转录活性，并呈现明显的浓度依赖性。其EC50值分别为21μmol/L和46μmol/L。2）以AngⅡ100nmol/L慢性长期刺激肾小管上皮细胞，细胞衰老生物标志物偏酸性β-半乳糖苷酶染色程度较空白对照组明显升高，klotho mRNA表达水平降低。3）淫羊藿苷和何首乌二苯乙烯苷与AngⅡ诱导的衰老细胞共同孵育后，其β-半乳糖苷酶染色程度较模型组降低，klotho mRNA表达水平上调，klotho和FoxO1蛋白表达增加。4）与模型组自发性高血压大鼠（SHR）比较，淫羊藿苷和何首乌二苯乙烯苷均表现出肾脏保护作用，能调节血清钙的水平，增强骨密度和骨强度，明显促进中医“肾”相关脏器（大脑、海马、睾丸、肾脏）中长寿基因klotho的表达，促进klotho蛋白在肾脏、大脑、睾丸、膀胱和脑垂体组织中的表达，其表达较强的部位是肾脏的远曲小管上皮细胞、睾丸生精小管的延长精细胞和脑室内的脉络膜，提示klotho表达变化的器官和部位与中医“肾藏精”脏象理论具有一致性。5）在机制探讨上，我们发现在klotho启动子-256位点HIF-1辅助序列（HAS）CAGGT基序处可能存在淫羊藿苷激活klotho基因表达的重要调控元件。.由本项目资助发表论文3篇，其中SCI收录1篇，另有1篇SCI论文在返修中；参加国际会议交流2次，国内会议交流3次；获奖1次；培养硕士研究生1名。